[发明专利]一种苹果病毒检测方法及其使用的检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及植物病毒的检测领域，特别涉及一种苹果病毒的检测方法及其使用的检测试剂盒。

背景技术

植物病毒病害难以用化学药剂进行有效的预防或控制，其扩展蔓延速度之快，危害之重，已超过真菌、细菌病害。从根本上讲，防治植物病毒病害发生最有效的方法是传播的预防，而检测是预防的关键。因此，发展一种高效灵敏、快速准确的植物病毒检测方法成为研究的首要问题。

目前植物病毒的检测方法很多，归纳起来主要有两类：酶联免疫吸附反应法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和分子生物学方法，但这两种方法都存在着一些不足之处。ELISA法检测植物病毒时，灵敏度较低，操作手续较为繁琐，而且因蛋白质的热变性容易造成漏检。分子生物学方法中普遍采用PCR法。PCR法是特异性扩增植物病毒中的保守核酸序列从而达到检测的目的，运用PCR技术可使样品DNA中存在的仅有一个拷贝的特定核苷酸片段得到大量扩增，用于植物病毒的鉴定与分类，该法灵敏度高、特异性强、快速简便，当样品病毒含量低，ELISA法难以检出时，此法往往能得到满意的效果。但是该方法容易产生非特异性扩增和假阳性结果，而且电泳中所使用的嗅化乙锭(ethidiumbromide，EB)对操作人员有毒害作用。因此，发展一种安全、价格低廉、方便实用的新型植物病毒检测方法是许多科学家的梦想和目标。

本发明以标记的DNA杂交形成双链，通过双链取代的方式检测植物病毒，从而建立一种价格低廉、对植物病毒具有高灵敏度和高特异性的检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的是要解决现有技术灵敏度低、操作繁琐、易漏检、易产生非特异性扩增和假阳性结果的缺陷，利用纳米金的超猝灭性、DNA杂交和双链取代的特性，提供一种高灵敏度、高特异性、方便实用、安全的苹果病毒检测方法及其使用的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

苹果病毒检测方法，特殊之处在于以巯基标记的DNA作为捕获探针，以荧光基团标记的DNA作为信号探针，二者杂交形成双链DNA，双链DNA探针组装在纳米金颗粒上构建纳米金核酸探针，通过双链取代的方式检测植物病毒并对碱基突变序列进行区分。

该方法具体包括以下步骤：

(1).以巯基标记的DNA作捕获探针、荧光基团标记的DNA作为信号探针，二者在杂交缓冲液中杂交形成双链DNA溶液；

(2).步骤(1)制得的双链DNA溶液与纳米金溶液混合，双链DNA通过Au-S共价键连接至纳米金表面，制得纳米金核酸探针溶液；

(3).步骤(2)中制得的纳米金核酸探针溶液与检测缓冲液混合，纳米金的终浓度为1-2nmol/L；

(4).将步骤(3)中所得混合液中添加人工合成苹果病毒寡核苷酸或待测苹果样本的RNA提取液，观察荧光现象，完成对苹果病毒的识别。

所述杂交缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐缓冲液，其pH为7.2-7.5，并包括0.135-0.138mol/L的NaCl和2.5-2.8mmol/L的KCl；所述检测缓冲液为浓度为0.005-0.015mol/L的磷酸盐溶液，其pH为7.2-7.5，并包括0.05-0.15mol/L的NaCl和0.5-1.5mmol/L的MgCl₂。

所述巯基标记的DNA捕获探针和荧光基团标记的DNA信号探针按1︰1.1—1：1.3的浓度比杂交。

所述巯基标记的DNA捕获探针，其巯基标记在3’端，包括21个核苷酸与靶序列互补的识别序列和9个腺嘌呤(A)；所述荧光基团标记的DNA探针，其荧光基团标记在5’端，包括10个核苷酸，与巯基标记的DNA探针的一部分完全互补，且互补碱基的部分从巯基标记的DNA探针的邻近9个连续A的第一个核苷酸开始；所述荧光基团为FAM羧基荧光素或花青染料Cy3。

所述双链DNA溶液与纳米金溶液按照298:1—302:1的浓度比合成纳米金核酸探针溶液，每个纳米金颗粒表面组装40-50个双链DNA分子，其包括30个巯基标记的DNA捕获探针和10个荧光基团标记的DNA信号探针。

所述纳米金核酸探针溶液与检测缓冲液按照1:2的体积比混合。

所述纳米金的粒度为13-15nm，浓度为3nmol/L。

该检测方法所使用的检测试剂盒，其特殊之处在于包括上述方法制备的纳米金核酸探针溶液，盒内还设有检测缓冲液、人工合成苹果病毒寡核苷酸粉末。