[发明专利]一种试剂及其在硫化氢检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及硫化氢的检测技术，具体涉及一种试剂及其合成方法，以及这种试剂在检测硫化氢中的应用。

背景技术

硫化氢具有臭鸡蛋味一直被视为环境有毒气体。然而，最近的研究表明H₂S是除了两种众所周知的气体信号传送器一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)外的第三种具有细胞保护作用的内源性气体信号化合物。硫化氢在许多病症中具有保护作用：如血管生成、血管舒张、细胞凋亡、炎症调节、神经调制等。另一方面，细胞中异常硫化氢水平能引起许多疾病如阿尔茨海默氏病、唐氏综合征、糖尿病、肝硬化。这些新兴的生物学作用的发现导致人们对H₂S的研究兴趣与日俱增。因此，要求发展快速、准确、可靠的方法来检测H₂S，以便为更好地理解它的生物学功能提供有用的信息。近年来，一些仪器的分析技术已经发展到检测各种环境，医疗和细胞中的H₂S。事实上，基于荧光的测定法，因为发射信号的快速、非破坏性、选择性、敏感的优点在活细胞，组织和生物体的各种分析物的荧光成像上有广泛的用途。在本发明中我们合成了一种新的化合物，5-曡氮荧光素醌，通过H₂S将曡氮还原为胺基，化合物的荧光性质在反应前后的变化实现了硫化氢的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种选择性高、水溶性好的定量检测硫化氢的试剂，以及该试剂在硫化氢检测中的应用。

本发明提供的快速检测硫化氢的试剂和方法，是基于一种5-曡氮荧光素醌，在pH为7.4的HEPES溶液和乙腈混合溶液中定量地检测硫化氢的含量。该检测方法，对硫化氢显示了高的灵敏性和选择性，检测过程简便、灵敏、快速，检测结果准确。

该试剂的结构式是：

该试剂的合成方法，步骤为：将5-氨基荧光素溶解在体积比2:1的醋酸和H₂O的混合溶液中，冷却到0℃，然后加入NaNO₂搅拌15分钟，再加入NaN₃，在0℃反应1小时，升温到室温再反应1小时，悬浮液真空抽滤，固体用盐酸和水洗涤，真空干燥后，得到黄色的5-曡氮荧光素醌固体；5-氨基荧光素、NaNO₂和NaN₃的摩尔比1:1.5:1.5。

用该试剂检测硫化氢的方法，步骤为：

(1)、配制pH＝7.4、浓度为10mM的HEPES缓冲溶液，配制2mM的5-曡氮荧光素醌的乙腈溶液；

(2)、按体积比1000:1000:1，将HEPES缓冲溶液、乙腈溶液和5-曡氮荧光素醌的乙腈溶液加到干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入,531nm的荧光强度逐渐增强；

(3)、用蒸馏水配制2mM的硫化氢溶液；把1mL的HEPES缓冲溶液、1mL的乙腈溶液1μL的5-曡氮荧光素醌乙腈溶液加到另一个荧光比色皿中，分别在加入硫化氢溶液的体积为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μL时，在荧光分光光度仪上测定531nm对应的荧光强度F为95、175、273、382、467、539、643、717、802、883，以硫化氢浓度为横坐标，以相对荧光强度F－F₀为纵坐标绘制图，F₀﹦17，得到硫化氢浓度的工作曲线；线性回归方程为：F－F₀＝-3.14+440c，c的单位为μM；

(4)、将HEPES缓冲溶液1000uL、乙腈溶液1000μL和5-曡氮荧光素醌乙腈溶液1uL加到干净的荧光比色皿中，用微量进样器吸取VμL待测样品溶液，加入到此干净的荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，将测得的荧光强度代入(3)的线性回归方程，得到浓度c，待测样品C_待测样＝(2000+V_待测样)μL×c×10^-6/VμL,即可求得硫化氢的浓度。

本发明具有如下优点和效果：1、合成了一种新型的醌类化合物；2、本发明的检测方法，对硫化氢显示了高的灵敏性和选择性；3、检测手段简单，只需要借助荧光分光光度仪即可实现。

附图说明

图1a实施例1制备得到的试剂的核磁¹HNMR图谱

图1b实施例1制备得到的试剂的核磁¹³CNMR图谱

图1c实施例1制备得到的试剂的质谱图

图2实施例2试剂与硫化氢作用的荧光发射图