[发明专利]热稳定性高的重组产植酸酶工程菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和微生物领域，具体而言，涉及一株热稳定性高的重组产植酸酶工程菌及其制备方法。 

背景技术

肌醇六磷酸酯，又名植酸是一种广泛存在于植物中的有机磷酸化合物，是一种广谱性的抗营养因子，因此被视为饲料中的有害成分。目前，植酸酶作为一种绿色添加剂在饲料工业中广泛应用，可使饲料中的磷利用率增高，降低植酸盐的抗营养作用。但植酸酶天然材料中含量低，热不稳定性不能完全满足工业要求，使得其在推广中存在阻力。因此，利用基因工程手段改造植酸酶，提高其酶活及热稳定性成为研究热点。易错PCR技术和DNA改组技术均属于在DNA水平上构建突变体库，主要通过人为控制，增加突变的几率，同时控制的一定的方向，具有一定的目标性。与常规突变技术相比，DNA改组有以下显著优点：①DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率；②DNA改组可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可以达到几十KB；③DNA改组从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片断上序列的信息，简化了操作程序；④通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高。可以看出，DNA改组比随机突变具有较大的优势。 

发明内容

本发明的目的是提供热稳定性高的重组产植酸酶工程菌及其制备方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案： 

本发明一方面涉及植酸酶工程菌，其特征在于相对于一般植酸酶，其2个氨基酸位点发生改变，即172位的谷氨酰胺(Gln)突变为精氨酸(Arg)，432位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)。 

在本发明的一个优选实施方式中，所述的植酸酶工程菌氨基酸序列为SEQIDNO.1 

本发明另一方面涉及上述植酸酶工程菌的制备方法，其特征在于通过DNA改组技术产生植酸酶工程菌基因突变，通过转染表达得到植酸酶工程菌。 

本发明采用突变菌株和经点突变改造得到的突变菌株的植酸酶工程菌基因为模板进行DNA改造，构建植酸酶工程菌突变体库，获得重组的基因工程菌，其酶活及热稳定性均有所 提高。 

具体实施方式：

1、通过DNA改组技术进行植酸酶工程菌突变体库的构建 

将本实验室前期获取的PP-NP^m-8、PP-NP^ep-6A、PP-NP^m-44-252、PP-NP^ep-11C菌株(上述菌株公开于《定向进化技术提高重组突变黑曲霉N25植酸酶酶活及热稳定性的研究》，硕士研究生学位论文，廖燕，2012)的总DNA提取后，分别通过KOD高保真酶扩增植酸酶基因，纯化回收后并等比例混合，用DnaseI酶切成随机片段，反应体系为50μL含上述DNA各10μL，10×DnaseIBuffer4.5μL，DnaseI1μL，ddH₂O补足。25℃处理20min，70℃处理10min使酶失活，回收小片段。 

然后合成In-fusion反应的引物phy1和Phy2，序列分别为 

5’-AGCTTACGTAGAATTCCTGGCAGTCCCCGCCGAGAAATC-3’和