[发明专利]基因多态性与重症患者预后的相关性及研究方法

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，涉及CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性及研究方法。

背景技术

多种不同病因的重症患者具有共同的全身炎症反应(SIRS)的病理生理过程，可以导致多脏器功能损伤和死亡。SIRS引起肾上腺交感系统兴奋为特征的应激反应，调节机体各系统的功能，这是严重病理状态下的重要代偿反应，与重症患者的预后密切相关。

嗜铬粒蛋白A(ChromograninA，CHGA)是肾上腺髓质中含量最大的激素前蛋白，在体内可分解为一系列有多种生物活性的多肽片段，具有调节儿茶酚胺分泌，改善血管内皮细胞功能、抗菌、免疫趋化和调控心脏功能等多种重要的生理功能。本课题组前期的研究表明，CHGA的血浆浓度在重症患者中明显增高，且与患者的危重程度相关和预后相关。

已有的研究表明，CHGA启动子部分的多态性与影响机体的交感神经系统的活性，与高血压和高血压相关肾病的发病相关。我们的前期研究表明，CHGA血浆水平与重症患者的预后相关。这些结果均提示作为与儿茶酚胺共储存同分泌的肾上腺髓质的重要激素前蛋白CHGA，可能在重症患者应激反应的病理过程中的参与到机体代偿调节的核心机制。

转录的起始是基因表达的关键阶段，启动子的结构可以通过影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。CHGA启动子的基因多态性是否与重症患者的预后相关，还从未有研究。我们假设CHGA的启动子的SNP会影响到重症患者预后，在本前瞻性队列研究中，我们筛选出已知对CHGA表达有显著意义且MAF较高的启动子位点-462(rs9658634)，-415(rs9658635)，通过对SNP基因型和重症患者的临床特点的分析，验证相关CHGA的SNP因素是否对重症患者预后的影响。

发明内容

本发明在于CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性。

进一步，-415位点突变组患者比野生组患者生存情况更差，具有更高的30d死亡率。

本发明还提供CHGA-415/462基因多态性与重症患者预后的相关性研究方法：首先准备全血总DNA提取试剂盒、DNATaq酶、DNA1000Maker以及引物，选择入住ICU的患者，对患者进行DNA提取并进行CHGA-415/462位点基因型分型；记录所有患者一般情况，对所有患者进行入住ICU第1d的危重症评分，以30d死亡率作为评估终点。

进一步，全血总DNA提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组提取试剂盒，货号DP319，所述DNATaq酶、DNA1000Maker以及引物均购自大连宝生物工程有限公司，引物序列由Primer5软件设计：上游AGGGAAGGGAGAACAG，下游：CGTTGTCCAGAAGGCAGTAGG。

进一步，入住ICU的患者的选择，排除以下情况的患者：入住ICU不足24h；病例资料不全；未获得知情同意书签字；多次入住ICU患者；神经内分泌肿瘤及肿瘤晚期患者；心肺骤停后复苏；少数民族和外籍患者；DNA提取及PCR扩增实验失败的患者。

进一步，对患者进行DNA提取并进行CHGA-415/462位点基因型分型过程为患者入住ICU后24h内，收集患者外周静脉血5ml按照全血总DNA提取试剂盒说明书进行全血基因组提取，基因型的测定通过PCR目的片段扩增和基因测序判定，按照天根DNA萃取柱提取技术操作使用外周血1ml经蛋白酶K处理后提取DNA，DNA浓度为25～30ng/ml，使用70ngDNA作为模板用于目的片段扩增，PCR扩增体系：DNA1.5μl，上下游引物各1.0μl，DNATaq酶预混Mix12.5μl，ddH₂O8μl，目的片段长度为353bp，PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序，并进行-415/462SNP位点基因型鉴定，基因型测定为盲法执行。

进一步，记录所有患者一般情况包括年龄、性别、感染情况、有无感染、白细胞计数、降钙素原、呼吸功能相关情况、循环情况、肝肾指标；对所有患者进行入住ICU第1d的危重症评分：APACHEII评分、SAPSII评分、SOFA评分。

附图说明

图1是CHGA-415T/C多态性对重症患者死亡影响的生存分析曲线。

具体实施方式

1.1材料准备：