[发明专利]一种蟾酥药材中蟾蜍甾二烯类成分指纹图谱的检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及中药成分分析检测技术领域，具体涉及一种蟾酥药材中蟾蜍甾二烯类成分指纹图谱的检测方法及其应用。

背景技术

2010版《中国药典(一部)》收载蟾酥作为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液经加工干燥后制得的药材。其性状呈扁圆形团块状或片状，团块状者质坚，不易折断，断面呈棕褐色，角质状，微有光泽；片状者质脆，易碎，断面红棕色，半透明。蟾酥味初甜而后有持久的麻辣感，粉末嗅之作嚏。具有解毒，止痛，开窍醒神的功效，主治痈疽疔疮，咽喉肿痛，中暑神昏，腹痛吐泻等疾病，具有非常良好的疗效。

蟾酥中化学成分复杂，含有大量的蟾蜍毒素类化合物，具有显著地强心活性，化学结构属于甾体类化合物，其母核C₁₇侧链为六元不饱和内酯环，也称为蟾蜍甾二烯类物化合物。目前，《中国药典(一部)》收载蟾酥中蟾蜍甾二烯类成分的试管显色反应鉴别和TLC鉴别法，同时，《中国药典》已收载蟾酥的含量测定方法，以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为含量测定指标性成分，但并未收载蟾酥中其它蟾蜍甾二烯类成分的检测和定量方法，其前处理及HPLC的检测条件亟待摸索。

中药指纹图谱技术作为一种多组分复杂样品的有效质量控制方法，能够反映出待测样品的整体性和特征性，在中药的药材鉴别、生产工艺、质量控制等方面应用广泛。目前，对于蟾酥的研究多为含量测定方法的研究，并没有关于采用指纹图谱对蟾酥中蟾蜍甾二烯类成分进行定性的系统性研究。

目前，现有检测方法对于蟾酥中蟾蜍甾二烯类多种成分一次样品制备后，并不能一次进样全面分析。同时，经查阅文献，现有文献报道的用于测定蟾酥中蟾蜍甾二烯类成分的HPLC方法中多使用乙腈-缓冲盐系统或甲醇-缓冲盐系统作为流动相。其中，复杂缓冲盐系统会使色谱柱使用寿命降低以及溶液配制时的繁琐耗时。

因此，有必要采用优化的色谱条件及供试品制备方法，建立了蟾酥中蟾蜍甾二烯类成分的指纹图谱，同时建立了基于指纹图谱的多成分含量测定方法，以一次样品制备、一次进样分析，同时完成定性和定量分析，使指纹图谱在蟾酥的质量控制中更具意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种蟾酥药材中蟾蜍甾二烯类成分指纹图谱的检测方法及其应用，采用优化条件的高效液相色谱方法建立了蟾蜍甾二烯类成分中5种主要活性成分(日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基)的指纹图谱，并且同时一次对这5种主要成分进行定量分析。本发明中方法通过指纹图谱和多成分含量测定可以比较全面的反映蟾酥药材中蟾蜍甾二烯类成分的主要活性成分，进而反映蟾酥药材的内在质量，为蟾酥药材判断真伪、评价优劣、考察稳定性和一致性提供依据。

为实现上述目的，本发明首先提供一种蟾酥药材中蟾蜍甾二烯类成分指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

较佳的，所述蟾酥药材中蟾蜍甾二烯类成分为日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基。

1)供试品溶液的制备：称取蟾酥细粉，加入甲醇，称重，超声提取，冷却后，再称重，用甲醇补足失重，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；

较佳的，所述步骤1)中，超声提取所加入的甲醇为蟾酥细粉的100～200倍量。优选的，所述超声提取所加入的甲醇为蟾酥细粉的100倍量。

具体的，所述超声提取所加入的甲醇为蟾酥细粉的100～200倍量是指，甲醇加入体积量为所述蟾酥细粉含量的100～200倍，即每0.1g的蟾酥细粉中加入甲醇10～20ml。优选的，当所述蟾酥细粉的含量为0.1g时，所述甲醇的加入量为10ml。

所述蟾酥细粉和甲醇称取时，应当精密称取。

所述甲醇为100％纯甲醇。

较佳的，所述超声提取时间为20～45min。优选的，所述超声提取时间为30min。

所述过滤是指：取摇匀后溶液的上清液过滤膜，放弃初滤液后，即得续滤液。

2)对照品溶液的制备：分别精密称取日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品适量，加甲醇溶解并定容，摇匀，得到混合对照品溶液；

较佳的，所述对照品溶液中日蟾毒它灵的CAS号为465-11-2；蟾毒它灵的CAS号为471-95-4；蟾毒灵的CAS号为465-21-4；华蟾酥毒基的CAS号为470-37-1；脂蟾毒配基的CAS号为465-39-4。