[发明专利]一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物肽及其制备方法与应用，具体涉及一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用。

背景技术

高F值寡肽是一种支链氨基酸和芳香族氨基酸摩尔数比值大于20的生物活性寡肽混合物。它不仅能减轻肝性脑病症状、改善肝功能和肝昏迷程度，还对蛋白质营养失常患者有积极作用。在实际生产中，高F值寡肽可以广泛应用在治疗肝脏疾病的药品、护肝食品、外科手术病人的蛋白营养食品、消化酶缺乏患者的肠道营养剂和高强度劳动者的食品营养强化剂等方面。高F寡肽混合物较支链氨基酸配方更具有实际效用，其独特生理功能已受到多方人士的高度关注，具有良好的发展前景。

水蛭俗称蚂蝗，是中国传统的药用水生动物，具有治疗中风、淤血肿痛、高血压、闭经等疾病的功效，其中以宽体金线蛭最为常见。宽体金线蛭(Whitmania Pigra)，隶属于真蛭亚纲(Euhirdinea)、无吻蛭目(Arhynchobdelliada)、黄蛭科(Haemopidae)、金线蛭属(Whimania)，《中国药典》2010年版中记载为“蚂蝗W.pigra Whitman”，广泛分布于我国大部分地区的湖泊、池塘及水田，其干体的蛋白含量在70％～80％之间，是目前我国中药材市场中主流的水蛭品种。国内中药材市场上的主流药用水蛭品种。好几个世纪以前，人类就已经成功利用水蛭进行相关疾病预防和治疗，但是，随着医疗技术的不断发展，能起相同疗效的药物如阿司匹林、硝酸甘油等的相继出现，水蛭的作用渐渐被被世人所遗忘。目前，市面上的水蛭产品主要以抗凝血、抗血栓为主，产品种类较为单一，因此探索水蛭更丰富的应用潜能，开发一种方法简便、成本较低、容易吸收的水蛭高F值寡肽具有一定的市场价值。本发明以水蛭干粉作为原料，利用酶工程技术和现代分离纯化技术，生产一种纯天然、易吸收的高F值生物活性寡肽混合物，这一研究为宽体金线蛭资源的合理运用开发提供依据，为进一步提高其附加值提供重要的运用途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水蛭高F值寡肽及其酶解制备方法与应用。本方法所采用的碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶为商业用酶，价格相对低廉，易于实现工业化。

本发明的目的由以下方案实现：

(1)将水蛭干燥体用清水洗净，并于去离子水中浸泡8～24h，再于分析纯乙醇中浸泡8～24h，干燥粉碎，得到水蛭干粉，置于-4～-20℃冷藏备用；

(2)称步骤(1)得到的水蛭干粉，加水溶解，按干粉与水重量比为1～8：100配制悬浊液，调整pH至8～11，浸泡10～60min，再调节pH至7.5～11，加入碱性蛋白酶，反应温度保持在30～80℃，酶解1～6h；煮沸5～30min，灭酶活，冷却，4000～10000r/min离心5～20min，收集上清液，调节pH至7～10，加入木瓜蛋白酶，反应温度保持在25～80℃，酶解1～6h；煮沸5～30min，灭酶活，冷却，4000～10000r/min离心5～20min，收集上清液，调整pH至2～7，按活性炭重量与上清液体积比0.2～20g：100mL加入活性炭，在25～60℃下吸附30～100min，4000～10000r/min离心5～30min，收集上清液；

(3)装柱：根据层析柱体积称量适量Sephadex G-15凝胶填料进行溶胀处理，排除破碎颗粒，按照1.6×120cm的规格填层析柱，以去离子水冲柱稳定；

(4)Sephadex G-15凝胶过滤：加入经活性炭静态吸附的酶解液，以去离子水洗脱，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300—1500Da的洗脱液，富集浓缩，冷冻干燥，得到水蛭高F值寡肽粉。

优选地，所述的水蛭为宽体金线蛭Whitmania Pigra。

优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述pH调至以8～11，调节pH至7.5～11，调节pH至7～10具体为：用0.1-2mol/L NaOH将pH调至所述pH值；所述收集上清液，调整pH至2～7具体为：用0.1-2mol/L的HCl将pH调至2～7。

优选地，所添加的碱性蛋白酶为Alcalase2.4L，酶活力3.9323×10⁵U/mL，所添加的木瓜蛋白酶为Papain，酶活力0.8231×10⁵U/g。

优选地，所述碱性蛋白酶添加量为4000～15000U/g pro，优选6000～13000U/g pro；所述木瓜蛋白酶添加量为按2000～10000U/g pro，优选2000～8000U/g pro。