[发明专利]一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法

权利要求书

1.一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)第一阶段：向贴壁培养的鼠胚胎干细胞团状克隆中加入含有dorsomorphin与noggin、SB431542和CHIR99021的诱导培养基，连续培养若干天，细胞每天换液,诱导鼠胚胎干细胞形成玫瑰花状神经球；

(2)第二阶段：消化并挑出第一阶段的神经球，加入含有bFGF的第二阶段诱导培养基悬浮培养形成悬浮的神经球；

(3)第三阶段：将神经球消化成单细胞，然后用第三阶段诱导培养基贴壁培养形成具有较长期的自我增殖与更新的神经上皮细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述第一阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、B27培养基、NEAA和β-Mercaptoethanol；第二阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、bFGF和葡萄糖；第三阶段诱导培养基包含有DMEM/F12神经基础培养基、N2培养基、B27培养基、胰岛素、葡萄糖、bFGF和EGF。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一阶段向鼠胚胎干细胞团状克隆中加入0.1～5μM的dorsomorphin、100ng/ml～500ng/ml(4.35～21.75nM)的noggin、5～30μM的SB431542和1～5μM的CHIR99021。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于第一阶段向鼠胚胎干细胞团状克隆中加入2μM的dorsomorphin、100ng/ml(4.35nM)的noggin、20μM的SB431542和3μM的CHIR99021。

5.一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的组合物，包括dorsomorphin、noggin、SB431542和CHIR99021。

6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于所述dorsomorphin、noggin、SB431542和CHIR99021的摩尔比为(100～5000):(4.35～21.75):(5000～30000):(1000～5000)。

7.一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化成神经元的方法，其特征在于采用如权利要求1-4之一项所述方法制备得到神经上皮细胞，进行贴壁培养，加入向神经元分化的普通诱导培养基或向中脑神经元分化的培养基，连续培养若干天，即得到普通神经元细胞或者中脑神经元。

8.一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化少突胶质前体细胞的方法，其特征在于采用如权利要求1-4之一项所述方法制备得到神经上皮细胞，进行贴壁培养，加入OPC诱导培养基，连续培养若干天，即得到少突胶质前体细胞，所述OPC诱导培养基包含有：DMEM/F12神经基础培养基，N2培养基,不含维生素A的B27培养基、Glutamax、bFGF、PDGF-AA和SHH。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于OPC诱导培养基包含有DMEM F12，1×N2，1×B27，20μg/ml胰岛素，1.6g/L葡萄糖、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF。

10.一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化少突胶质细胞或星形胶质细胞的方法，其特征在于采用如权利要求7所述方法制备得到少突胶质前体细胞，进行贴壁培养，加入少突胶质细胞诱导培养基或者星形胶质细胞诱导培养基，连续培养若干天，即得到少突胶质细胞或星形胶质细胞。