[发明专利]一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的组合物，尤其是利用该组合物快速直接定向的诱导鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，以及进一步将神经上皮细胞定向诱导分化成神经元细胞或神经胶质细胞的方法。 

背景技术

神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自我更新能力的母细胞，存在于成体脑组织中的一种干细胞。主要分布在脑室管膜，室下区，纹状体，海马齿状回等区域,是成年神经系统中可以自我更新和分化为多种神经类细胞的一种多能细胞，其可分化为多种神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞等。神经干细胞的发现，给中枢神经系统损伤和其他大脑退行性疾病的治疗带来了希望。NSCs作为一种全新的生物学治疗方法，随着分离培养、体外扩增等技术的日臻完善，NSCs在中枢神经损伤修复中具有潜在的应用价值，其应用主要集中以下几方面：一是直接细胞移植进行替代治疗，神经干细胞作为细胞移植的来源，可以通过神经干细胞的体外移植或体内神经干细胞的激活，分化为神经元和胶质细胞，与已经存在的细胞结构整合到一起；二是以NSCs作为基因载体，携带治疗作用的报告基因进行移植，从而达到细胞替代和基因治疗的双重作用；三是通过对生长因子和细胞因子的研究，诱导自身的NSCs分化进行神经自我修复。由于神经干细胞是从大脑组织中提取出来的成体干细胞，来源非常有限，目前在临床应用的可能几乎为零。因此，急需一个替代物来取代其治疗价值。 

小鼠胚胎干细胞于1981年首次由Evans和Kaufman成功分离建系，它们来源于胚泡的内细胞团(inner cell mass,ICM)，这些细胞具有稳定的二倍体核型，在体外可以分化为三个胚层的多种细胞。将小鼠胚胎干细胞重新植入胚泡可以参与形成胚胎。体外ES细胞维持未分化状态依赖于一些细胞因子的存在，如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)。撤去这种自我更新的刺激信号后，ES细胞很快分化为多种细胞。这些属性使ES细胞成为非常有用的发育生物学和功能基因组学研究的生物系统。 

神经上皮细胞是一种干细胞，可细胞分裂产生两个完全相同的细胞。而后，子细胞会经由不对称的细胞分裂，产生一个与亲代相同的细胞及另一个非干细胞的先驱细胞或神经 元。文献(Billon N,Jolicoeur C,Ying QL,et al.,Journal of Cell Science,2002,115)公开了一种诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经上皮细胞的方法，然而这种利用EB自然分化产生的神经上皮细胞，分化比例非常低，而且是瞬时产生的不具有较长期的自我增殖与更新的能力，无法做为细胞产物长期体外培养，冻存与利用。 

文献(Falk A,Koch P,Kesavan J,et al.PLOS One,2012,7)公开了一种诱导人胚胎干细胞分化为可以较长时间进行自我增殖与自我更新的神经上皮细胞的方法，但是其是通过自然分化的方法同时加入生长因子EGF和bFGF，诱导时长达30天以上，其利用价值大大降低。也有研究者通过加入SMAD信号通路的两种抑制剂Noggin与SB431542，诱导人胚胎干细胞分化为神经干细胞，但其诱导效率较低，且耗时较久(Chambers,S.M.,et al.,Nat Biotechnol,2009.27,3)。 

小鼠和人的ES细胞有较大差异： 

1.二者的形态不同：小鼠ES细胞形成多层鸟巢状的集落，难以分清单个细胞，人ES细胞形成相对扁平的单层细胞集落，单个细胞密集排列，可见清晰的核仁(Buecker C,Geijsen N,Cell Stem Cell,2010,7)； 

2.二者维持未分化的机制不同(Hanna J,Markoulaki S,Mitalipova M,et al,Cell Stem Cell,2009,4)； 

3.二者表达的分子标志有所不同(Takahashi and Yamanaka,Cell,2006,126；Takahashi K,Yamanaka S,Cell,2007,131)。因此在实际中，小鼠和人的ES细胞研究工作是各自相对独立的研究体系。 

目前尚无一种方法可以快速直接定向诱导鼠胚胎干细胞分化为具有自我更新与增殖能力的神经上皮细胞。 

发明内容