[发明专利]脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及神经生物学领域，特别涉及一种将脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，本发明还涉及培养得到的神经细胞。

背景技术

脐带间充质干细胞(MSC)是中胚层起源的，能够进行自我更新，并具备向成骨、软骨和脂肪三种中胚层系细胞分化潜能的一种成体干细胞。近年来研究发现MSC在中胚层之外，还可以跨胚层进行转分化，如分化成外胚层系的神经细胞和上皮细胞以及内胚层系的肝细胞和胰腺细胞。因为MSC来源广泛，易于分离培养，免疫原性较低，且不存在胚胎干细胞所面临的伦理学问题，这使其在再生医学方面的应用具备了其他干细胞所没有的优势。中枢神经系统的神经退行性疾病如帕金森氏综合征以及外部创伤造成的神经损伤等长期困扰人类的问题也因此将有更为现实可行的解决之道。

过去几年来，国内外许多研究小组报道了体外将MSC定向诱导分化为神经元、胶质细胞的方法。

MSC定向诱导分化为神经细胞的实验研究有少数国外研究机构正在进行，而国内研究很少，而且现有报道的诱导分化方法诱导周期长，得到的神经细胞分化效率低、细胞分化均一度低。

发明内容

本发明目的是提供一种在体外将人脐带间充质干细胞诱导培养分化成神经细胞的新方法，同时制备得到分化的神经细胞。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种脐带间充质干细胞诱导培养为神经细胞的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、脐带间充质干细胞的培养和扩增：获得脐带间充质干细胞单体，将脐带间充质干细胞单体按1-5×10⁵/ml接种于脐带间充质干细胞培养液中，每3-8天换液传代一次，得到培养的细胞；

所述脐带间充质干细胞培养液含DMEM/F12，2％B27，2-4mM L-谷氨酰胺，1mM硫代甘油(MTG)，1％非必需氨基酸，EGF20-40ng/ml，bFGF20-30ng/ml，80-90U/ml青霉素，60-70μg/ml链霉素；

(2)、预诱导分化：将步骤(1)得到的细胞按1～5×10⁴/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养3天后更换预诱导培养液进行培养，3天后半量换液，第3-4天时终止诱导；

所述预诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol～50nmol的维生素C，10-20U/ml人白细胞抑制因子，1-8mML-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油(MTG)，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素；

步骤(3)诱导分化：将步骤(2)得到的细胞按1～5×10⁴/ml的细胞密度接种进行贴壁诱导培养，贴壁培养2天后更换诱导培养液进行诱导培养，3天后半量换液，第3-6天时终止诱导，得到神经细胞；

所述诱导培养液为DMEM作为基础培养基，在此基础上还含有20nmol～50nmol的维生素C，30nmol～40nmol的维生素B1，0.01-0.02％的DMSO，0.1mM2-β-巯基乙醇，10-20U/ml人白细胞抑制因子，10-30U/ml碱性成纤维细胞生长因子，1-8mML-谷氨酰胺，2-5mM硫代甘油(MTG)，80-100U/ml青霉素，80-100μg/ml链霉素。

本发明所用培养液可在常用的细胞基本培养基的基础上补充一种或多种成分而得到。可用于本发明的细胞基本培养基可以包括但不仅限于：DMEM，DMEM/F12，2％B27。这些培养基的配方是本领域所公知的，不仅在普通教科书和实验手册中有详细描述，而且还可以直接以成品的形式从公司购买获得。

作为补充物的成分可以是任何维持或促进细胞生长的成分。他们可以包括但不限于：氨基酸、维生素、蛋白、激素、金属离子、微量元素、脂肪酸、糖等等。

本发明所用的所有试剂均可通过商业途径购买得到。

本发明所述方法获得的神经细胞至少具有如下特征之一：

(a)具有典型的细胞体、轴突和树突等细胞结构；

(b)至少表达蛋白：β-tublin III；

(c)神经细胞占诱导细胞群体86-91％左右；

(d)对外界刺激具有放电功能。