[发明专利]用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌及构建和应用

权利要求书

1.一种香草醛的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按异丁香酚:异丁香酚单加氧酶:缓冲液＝0.1～0.4g:0.2～1.2g:9～18mL加入反应容器中，在20～28℃下振摇转化12～48h，得到香草醛；所述缓冲液为pH8～10.4的甘氨酸/NaOH水溶液；

在所述反应容器中，添加香草醛吸附剂；每0.1～0.4g异丁香酚中：香草醛吸附剂的加入量≤0.6g，所述香草醛吸附剂是壳聚糖膜。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述异丁香酚单加氧酶是由大肠埃希氏菌发酵得到，所述大肠埃希氏菌命名为BL21(DE3)IEM-PP，保藏编号为CGMCC No.8918，包括如下步骤：

(1)将大肠埃希氏菌接种至发酵培养基，得到菌浓度OD_600nm＝0.1-0.2的发酵初始体系；

(2)将所述发酵初始体系进行如下发酵：先在35-37℃下振荡培养3-5小时，然后加入IPTG至IPTG在所述述发酵初始体系中的终浓度为50-100μM，然后在25-30℃下继续振荡培养12-48小时，得到异丁香酚单加氧酶。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基pH为7.0-7.2，包括10-15g/L胰蛋白胨、15-23g/L酵母提取物、5-10g/L氯化钠、10-15g/L甘油、10-17mM磷酸二氢钾和65-75mM磷酸氢二钾，余量为水。

4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：所述大肠埃希氏菌以种子液的形式用移液器接种至所述发酵培养基，所述种子液占所述发酵培养基的体积分数为0.5-2％，所述种子液是将所述大肠埃希氏菌接种至种子培养基，35-37℃振荡培养至菌浓度OD_600nm＝3-6形成。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述种子培养基pH为7.0-7.2，包括10-15g/L胰蛋白胨、5-8g/L酵母提取物、5-10g/L氯化钠、余量为水。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的大肠埃希氏菌的构建方法包括如下步骤：

(1)提取土壤的全基因组DNA；

(2)根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计PCR引物，所述PCR引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；

(3)以所述全基因组DNA为模板，用步骤(2)中的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，切胶回收得到大小为1438bp的目标基因SEQ ID NO.3；

(4)将目标基因SEQ ID NO.3插入T载体pET21(a)的Ndel和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒PET21(a)-IEM；

(5)将重组质粒PET21(a)-IEM转化得到所述大肠埃希氏菌。