[发明专利]用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌及构建和应用

说明书

技术领域

本发明涉及异丁香酚单加氧酶的基因工程菌的构建及其生物催化技术领域，特别是涉及一种用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌及构建方法和应用。

背景技术

香草醛是工业中应用最广泛的香料之一，大量用于食品工业，可作为香气修饰和定香的主要原料用于食品、牙膏、香皂、烟草中；在医药化工中作为重要的原料或中间体，可用于制造治疗高血压、心脏病、皮肤病及消除口臭、利尿的常用药物；在化学工业中可作为化学助剂，用于塑料制品的抗硬化剂以及Ni，Cr，Cd等金属的电镀光亮剂；在农业生产上，香草醛可作为作物增产剂和催熟剂，并用之制备除草剂和昆虫引诱剂等，需求量很大。香草醛目前主要由化学方法制备，但用化学合成法制得的香草醛不是天然香料。天然香草醛可以从香子兰的花荚中提取，但用植物组织提取的方法生产的天然香草醛量少而价高，不能满足日益增长的需求。

随着世界各国对食品安全越来越重视，对天然香草醛的需求越来越大。天然香料是指由动植物材料经物理(包括蒸馏、溶剂萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通过传统的食品加工方法(包括干燥、焙烤、发酵)加工后用于人类消费的物质。根据欧洲和美国立法，利用动植物资源通过物理方法、酶法或微生物法得到的物质才能称为天然物质(Muheim Andrea.US6,235,507.2001)。用生物法生产的香草醛，属天然产品，可以生物降解，符合消费者追求天然产品的消费心理。因此，利用生物转化技术生产生物香兰素，是一种有效的、很有前途的替代方法。

在过去的十年里报道了许多用微生物法或酶法生产香草醛的方法，一般都是通过微生物或酶将合适的前体转化为香草醛。目前，尚未有重组菌转化异丁香酚生产香草醛的任何报道。

发明内容

为了弥补上述现有技术的不足，本发明提供一种用于生产异丁香酚单加氧酶的工程菌(大肠埃希氏菌)及其构建方法和应用，该工程菌可用于生产异丁香酚单加氧酶，进而用于转化异丁香酚生产香草醛。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

一种用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该所述大肠埃希氏菌命名为BL21(DE3)IEM-PP，保藏编号为CGMCC No.8918。

本发明提供的工程菌属于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，命名为BL21(DE3)IEM-PP，已于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.8918。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)IEM-PP CGMCC No.8918简称大肠埃希氏菌BL21(DE3)IEM-PP。该大肠埃希氏菌BL21(DE3)IEM-PP可用于生产异丁香酚单加氧酶，并利用其转化异丁香酚生产香草醛。

一种上述大肠埃希氏菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取土壤的全基因组DNA；

(2)根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计PCR引物，所述PCR引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；

(3)以所述全基因组DNA为模板，用步骤(2)中的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，切胶回收得到大小为1438bp的目标基因SEQ ID NO.3；

(4)将目标基因SEQ ID NO.3插入T载体pET21(a)的Ndel和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒PET21(a)-IEM；

(5)将重组质粒PET21(a)-IEM转化得到所述大肠埃希氏菌。

一种所述的大肠埃希氏菌在生产异丁香酚单加氧酶中的应用。

优选地，所述的应用包括如下步骤：

(1)将所述的大肠埃希氏菌接种至发酵培养基，得到菌浓度OD_600nm＝0.1-0.2(如0.1-0.15或0.15-0.2)的发酵初始体系；

(2)将所述发酵初始体系进行如下发酵：先在35-37℃下振荡培养3-5小时，然后加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至IPTG在所述述发酵初始体系中的终浓度为50-100μM，然后在25-30℃下继续振荡培养12-48小时，得到氨基酸序列为SEQ ID No.4异丁香酚单加氧酶。