[发明专利]一种米根霉与皱褶假丝酵母偶联生产L-苹果酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵产有机酸领域，具体涉及一种利用米根霉与皱褶假丝酵母偶联制备L-苹果酸的方法。

背景技术

L-苹果酸是生物体三羧酸的循环中间体，口感接近天然果汁并具有天然香味，与柠檬酸相比，产生的热量更低，口味更好，因此广泛应用于酒类、饮料、果酱、口香糖等多种食品中，并有逐渐替代柠檬酸的势头。L-苹果酸是目前世界食品工业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。

L-苹果酸中含有天然的润肤成分，能够很容易地溶解粘结在干燥鳞片状的死细胞之间的“胶粘物”，从而可以清除皮肤表面皱纹，使皮肤变得嫩白、光洁而有弹性，因此在化妆品配方中备受青睐；L－苹果酸可以配制多种香精、香料，用于多种日用化工产品，如牙膏、洗发香波等；与柠檬酸相比，L－苹果酸其酸味柔和别致，因此国外将其用于替代柠檬酸作为新型洗涤助剂，用于合成高档特种洗涤剂。

L-苹果酸可用于药物制剂、片剂、糖浆中，还可以配入氨基酸溶液中，能明显提高氨基酸的吸收率；L-苹果酸可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用；还可用于制备和合成驱虫剂、抗牙垢剂等。另外L-苹果酸还可以作为工业清洗剂、树脂固化剂、合成材料增塑剂、饲料添加剂等。

目前，L-苹果酸的生产方法主要为微生物发酵法和酶法。微生物发酵法产L-苹果酸，又分为“一步发酵法”和“两步发酵法”。“一步发酵法”(即直接发酵法)，利用微生物(如黄曲霉、米曲霉、稗疣黑粉菌、温特曲霉等菌株)一步将葡萄糖、淀粉基碳源或富马酸等原料转化为L-苹果酸。“两步发酵法”采用两种不同功能的微生物，一种微生物先将葡萄糖或其他碳源转化为富马酸(延胡索酸)，再由另外一种微生物将富马酸转化为L-苹果酸。“两步发酵法”常采用的微生物主要有少根霉、华根霉、膜醭毕赤酵母、普通变形杆菌、短乳杆菌、产氨杆菌等。酶法生产L-苹果酸，以产氨短杆菌、黄色短杆菌、文氏曲霉等微生物作为产酶菌种， 经繁殖培育后获得延胡索酸酶，再以富马酸或富马酸盐为原料，经延胡索酸酶转化，直接生成L-苹果酸。微生物发酵法，由于菌种产苹果酸比较低，适应规模化生产的菌种较少，因此，未有工业化大规模生产报道；酶法制备L-苹果酸，虽有工业化报道，但由于其原料成本偏高，制约了大规模生产。

米根霉(Rhizopus oryzae)是美国FDA认证的公认安全(GRAS)的菌种，具备多种生物基化学品的生物制造能力，如乳酸、富马酸、苹果酸、乙醇等，发酵产物中不存在对人体和动物有害的物质。米根霉具有独特的优点：营养要求简单，培养基成本低廉；生长粗犷，不易染菌，且具备较强产酸能力和耐酸能力；下游分离纯化负担较轻；菌体易形成丝状或小球，可与发酵液分离，简化工艺过程。目前，米根霉广泛应用于L-乳酸和富马酸的发酵，但较少应用于L-苹果酸的发酵，且米根霉发酵为异型发酵，有多个发酵终产物，如富马酸、L-苹果酸等。

皱褶假丝酵母(Candida rugosa)，原名柱状假丝酵母，是一种半子囊不产孢子的假丝状单细胞非致病酵母真菌。该酵母通常被认为是对人类和其它生命形式都是安全的，主要应用于正烷烃转化富马酸、脂肪酶的生产。

但是未见米根霉与皱褶假丝酵母联合发酵生产L-苹果酸的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种米根霉与皱褶假丝酵母偶联生产L-苹果酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种米根霉与皱褶假丝酵母偶联生产L-苹果酸的方法，它包括如下步骤：

(1)皱褶假丝酵母经种子培养后，再经扩大培养，过滤回收菌体备用；其中，所述的扩大培养，先在33℃下发酵培养48h，再在35℃下继续发酵培养48h；

(2)米根霉经种子培养形成孢子悬浊液，再经发酵基础培养直至形成颗粒状菌体；

(3)将经过步骤(2)发酵基础培养后的米根霉接种于发酵培养基中，以碳酸钠控制pH值4.0～5.0，35℃下发酵生产富马酸和L-苹果酸，发酵48～60h后，用氨水调节pH值至7.5～8.0，再接入步骤(1)得到的皱褶假丝酵母，维持35℃，与米根霉共培养至全部富马酸转化为L-苹果酸。

步骤(1)中，所述的皱褶假丝酵母经种子培养和扩大培养后，菌体密度为30g湿菌体/L以上。