[发明专利]一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）设计引物：设计只能扩增猪线粒体DNA的猪特异性引物，所述特异性引物包括上游引物和下游引物两种，其序列如下：

上游引物F：5-ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC-3；

下游引物R：5-CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG-3；

（2）模板DNA提取：采用酚-氯仿法提取模板DNA，并于质量分数0.8%的琼脂糖电泳进行检测，提取的模板DNA于-20℃备存；

（3）PCR扩增引物及反应体系：反应总体系25uL，包括12.5uL的PCRMix，2.5pmol/L的步骤（1）制备的上游引物和下游引物各1μL，步骤（2）提取的模板DNA50～100ng，水补余；

（4）PCR扩增：在步骤（3）的条件下，依次进行预变性95℃、4min，变性94℃、45s，退火、猪特异性引物60℃、30s，延伸72℃、60s，连续进行35个循环，最后延伸72℃、7min，得到模板DNA即mtDNA的16SrRNA基因片段；

（5）扩增产物检测：将步骤（4）猪特异性引物扩增mtDNA得到的16SrRNA基因片段，用质量分数1.5%的琼脂糖电泳检测，将扩增后得到的基因片段进行序列测定，并根据测序结果进行同源性匹配判断。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述12.5uL的PCRMix包括PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L的dNTPs2.0μL，5U/μL的Taq酶0.5μL。

3.一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测试剂盒，其特征在于：包括特异性引物、DNA提取试剂、PCRMix以及水，所述的四种物质混合后即得到PCR反应体系混合液，所述PCR反应体系混合液中PCRMix为总混合液体积的0.5倍；所述特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物各为混合液总体积的1/25,；DNA总量为50-100ng；如果上述成分体积加起来不足总体积，不足的部分用水补足即可。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：PCR反应体系混合液的总体积为25uL，其中，所述的上游引物和下游引物各1uL；所述DNA提取试剂包括A溶液、B溶液、C溶液、D溶液、E溶液五部分，每克检测样本需1ml的A溶液；所述PCRMix的用量为12.5ul；水补余；

其中，A溶液：200μg/ml的蛋白酶K；10mmol/L的pH8.0的Tris－Cl；0.1mol/L的pH8.0的EDTA；质量分数0.5%的SDS；20μg/ml的RNaseA；

B溶液：平衡酚，并用0.5mmol/L的Tris－Cl饱和，pH8.0；

C溶液：氯仿/异戊醇，体积比为24︰1；

D溶液：冷无水乙醇AR；

E溶液：TE缓冲液，10mmol/L的Tris－Cl、1mol/L的pH8.0的EDTA。

5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中还可以含有琼脂糖，用于检测样本在提取模板DNA后来进行琼脂糖电泳检测，以及特异性引物扩增模板DNA既mtDNA得到的16SrRNA基因片段进行琼脂糖电泳检测，所述琼脂糖每次检测用量为3克。

6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述的上游引物和下游引物的序列如下：

上游引物F:5-ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC-3，

下游引物R:5-CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG-3。

7.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述B溶液用量为A溶液体积的0.5倍，C溶液用量与其相反应的上清液的体积相同，D溶液用量为1ml，E溶液用量为50-200ul。