[发明专利]一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种食品检测方法，具体地说是一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法及其试剂盒，属于食品检测方法领域。

背景技术

随着经济的发展和人民生活水平的提高，对牛、羊肉的市场需求将不断扩大，近年来一些不法分子为了谋取高额利润，在市场上出现一些在牛、羊肉中掺杂猪肉的假牛、羊肉等冷冻肉卷及肉片造假产品，还出现了一些以猪头肉、猪瘦肉，佐以八角、桂皮、花椒等调料一同熬成的“假肉汤”。这些以猪肉冒充牛、羊肉、以假充真、掺杂使假的违法行为，仅靠肉组织的形态学检查已不能满足对肉产品种属鉴定的需要。为更好保护新疆、宁夏以及周边中亚地区等地少数民族的风俗习惯，对其清真食品的食用安全提供保障，确保我国的社会稳定；故建立一种安全有效、准确、迅速鉴定各类制品中猪源性成分的检测方法成为当务之急。

目前分子生物学技术已越来越多地用于肉源种属的鉴定，具有重复性好、灵敏度高等优点，并可以克服形态学鉴定中主观性强等缺点。16SrRNA基因进化速度适中，遗传信息丰富，同时随着分子生物学技术的发展，DNA序列数据库也日益增长，在GenBank中已经积累了大量相关的序列信息资源，成为生物检材种属鉴定的基础。本发明即采用mtDNA16SrRNA基因序列直接测序的方法，实现对各类制品中猪源性成分的鉴定。

发明内容

为了解决上述问题，本发明设计了一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法及其试剂盒，利用线粒体DNA基因测序方法对各类制品中的猪肉源性进行分析鉴定，结果准确、灵明度高，能快速检测食品中所含的猪肉成分，不但杜绝了以猪肉冒充牛、羊肉、以假充真、掺杂使假的违法行为，也对新疆、宁夏和其周边的中亚地区等少数民族聚居区清真食品的食用安全提供了保障，也为我国社会的稳定提供了可靠的技术支持。

本发明的技术方案为：

一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测方法，具体包括以下步骤：

（1）设计引物：设计只能扩增猪线粒体DNA的猪特异性引物，所述特异性引物包括上游引物和下游引物两种，其序列如下：

上游引物F：5-ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC-3；

下游引物R：5-CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG-3；

（2）模板DNA提取：采用酚-氯仿法提取模板DNA，并于质量分数0.8%的琼脂糖电泳进行检测，提取的模板DNA于-20℃备存；

（3）PCR扩增引物及反应体系：反应总体系25uL，包括12.5uL的PCRMix，2.5pmol/L的步骤（1）制备的上游引物和下游引物各1μL，步骤（2）提取的模板DNA50～100ng，水补余；

（4）PCR扩增：在步骤（3）的条件下，依次进行预变性95℃、4min，变性94℃、45s，退火、猪特异性引物60℃、30s，延伸72℃、60s，连续进行35个循环，最后延伸72℃、7min，得到模板DNA即mtDNA的16SrRNA基因片段；

（5）扩增产物检测：将步骤（4）猪特异性引物扩增mtDNA得到的16SrRNA基因片段，用质量分数1.5%的琼脂糖电泳检测，将扩增后得到的基因片段进行序列测定，并根据测序结果进行同源性匹配判断。

其中，所述12.5uL的PCRMix包括PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L的dNTPs2.0μL，5U/μL的Taq酶0.5μL。

一种安全快速鉴定食品中猪源性成分的检测试剂盒，包括特异性引物、DNA提取试剂、PCRMix以及水，所述的四种物质混合后即得到PCR反应体系混合液的总体积为25uL，其中，所述特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物和下游引物各1uL；所述DNA提取试剂包括A溶液、B溶液、C溶液、D溶液、E溶液五部分，每克检测样本需1ml的A溶液；所述PCRMix的用量为12.5ul；水补余。

所述PCR反应体系混合液中PCRMix为总混合液体积的0.5倍；上游引物和下游引物各为混合液总体积的1/25,；DNA总量为50-100ng；如果上述成分体积加起来不足总体积，不足的部分用水补足即可。

另外，所述检测试剂盒中还可以含有琼脂糖，用于检测样本在提取模板DNA后来进行琼脂糖电泳检测，以及特异性引物扩增模板DNA既mtDNA得到的16SrRNA基因片段进行琼脂糖电泳检测，所述琼脂糖每次检测用量为3克。

其中，所述的上游引物和下游引物的序列如下：

上游引物F:5-ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC-3，