[发明专利]一种李氏木霉菌株及其制备方法

权利要求书

1.一种李氏木霉菌株，其特征在于，是于2014年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8807的菌株，菌株的名称为李氏木霉JL16。 

2.如权利要求1所述的李氏木霉菌株，其特征在于，所述的李氏木霉菌株JL6，采用三株纤维素酶高产菌株通过原生质体制备、原生质体分离、原生质体融合、原生质体再生和筛选的制备步骤构建；所述的三株纤维素酶高产菌株，是李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30。 

3.一种权利要求1的李氏木霉菌株的制备方法，有原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体的再生和筛选的过程； 

所述的原生质体的制备，是将李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌丝；将三株李氏木霉孢子悬液接种至种子培养基中，得到含有抱团菌丝体的李氏木霉；将菌丝体用pH6.5的柠檬酸缓冲液定容，离心，弃上清后重新补加柠檬酸缓冲液并混匀；再分别加入到去壁混合酶液中酶解细胞壁，得到含原生质体的溶液；最后经分离得到白色沉淀的李氏木霉原生质体； 

所述的原生质体的融合，用融合剂将三种白色沉淀原生质体一起吹溶，室温静置10～60min；所述的融合剂，由按下列重量配比的物质组成：20％～80％聚乙二醇、0.01～0.05M CaCl₂和0.2～1.0M山梨醇； 

所述的原生质体的再生，是将融合完的原生质体悬液用NaCl溶液梯度稀释，取稀释液涂在原生质体再生培养基上，28℃见光培养96h，保持相对湿度大于60％，直到长出透明圈；所述的再生培养基，由下列重量配比的物质组成：KH₂PO₄3～5g/L、NaNO₃2.6～3.0g/L、尿素0.5～1.0g/L、FeSO₄·7H₂O7.5～10mg/L、MnSO₄·H₂O2.5～3.0mg/L、ZnSO₄·7H₂O3.6～5.0mg/L、CoCl₂·6H₂O3.7～5.0mg/L、MgSO₄·7H₂O0.5～1.0g/L、CaCl₂0.5～1.0g/L、脱氧胆酸钠2～5g/L、蛋白胨10～15g/L、NaCl35～50g/L、琼脂16～20g/L、球磨纤维素20g/L； 

所述的筛选，是挑取透明圈直径/菌落直径大的菌株一环至甘油中，得到李氏木霉JL16于-80℃下保存。 

4.如权利要求3所述的李氏木霉菌株的制备方法，其特征在于，在原生质体的制备中，所述的柠檬酸缓冲液，由下列重量配比的物质组成：每升中含有0.1M柠檬酸溶液70ml、0.1M柠檬酸钠溶液930ml、NaCl0.6mol。 

5.如权利要求3所述的李氏木霉菌株的制备方法，其特征在于，在原生质体的制备中，所述的去壁混合酶液，由溶壁酶、蜗牛酶、纤维素酶，加入pH6.5柠檬酸缓冲液构成，各成分含量为溶壁酶2～8mg/ml、蜗牛酶2～8mg/ml、纤维素酶2～8mg/ml。 

6.如权利要求3所述的李氏木霉菌株的制备方法，其特征在于，在原生质体的制备中，所述的分离，使用的分离装置是由一支5～50ml的离心管，在距底部1～10cm处塞满脱脂棉，厚度约为1～5cm，底部插入枪头，用柠檬酸缓冲液浸湿脱脂棉，在分离装置顶部加入酶解后的菌液，1000～3000rpm离心8～10min，底部液体即为含有原生质体的稳渗液，取出分离装置中的脱脂棉，将分离装置底部液体分装至1～10ml离心管中，3000～8000rpm离心12～15min，去掉上清后底部残留的白色沉淀即为原生质体。 

7.如权利要求3所述的李氏木霉菌株的制备方法，其特征在于，在原生质体的再生中，所述的球磨纤维素，是经直径2～4mm的玻璃珠在200rpm下振荡处理48小时得到的纤维素。