[发明专利]一种李氏木霉菌株及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及通过原生质体融合技术构建的高产纤维素酶的李氏木霉菌株，以及李氏木霉的制备方法。 

技术背景

用于生产的纤维素酶一般来自于霉菌，比较典型的是木霉属。而李氏木霉则是木霉属中最为重要的一种，并在纤维素降解领域得到广泛应用。从分离得到第一株李氏木霉到现在，李氏木霉经历了多轮诱变、筛选，得到了包括MCG-77，QM9414，RUTC-30等众多高产菌株。 

工业生产上，一般使用真菌等生产纤维素酶，其中最著名的是李氏木霉，李氏木霉具有纤维素酶酶谱全、活力高的特点。自20世纪60年代以来，人们以野生菌株T.reesei QM6a为出发菌株，进行了大量的诱变育种工作，其中QM9414、RutC30和MCG77等能够大量表达内切和外切葡聚糖酶，是国内外纤维素酶生产的主要菌种。 

通过使用原生质体融合的方法能够得到高产纤维素酶的李氏木霉菌株。原生质体融合指通过人为的方法，把常规诱变所获得的优良性状菌株，通过原生质体融合集中到一个菌株中。目前，通过原生质体融合技术获得优良菌株的主要专利包括CN201210301323.5、CN201010210226.6、CN201010174196.8、CN200880132218.5等，这些原生质体融合主要采用“双亲灭活法”，操作方法仍需进一步简化，诱变率还需进一步提高。本发明选择三株纤维素酶高产菌株进行融合，从而提高纤维素酶系的整体活力。 

发明内容

本发明目的之一是通过多株李氏木霉的原生质体融合，得到一株纤维素酶高产菌株。 

本发明目的之二是建立李氏木霉诱变及筛选方法。 

原生质体融合在本质上是基因组水平的随机重组，它的一般步骤是，通过经典的诱变育种方法得到多个正突变菌株，也就是多样性的的基因组库，然后，将这些突变菌株制备成原生质体，通过原生质体融合，进行全基因组水平的随机重 组，筛选得到高产菌株。 

本发明对QM9414、RutC30和MCG77进行原生质体融合，通过筛选，得到纤维素酶高产菌株。同时，建立了李氏木霉原生质体制备、分离、融合、再生和高产菌株的筛选方法。本发明构建的高产纤维素酶(李氏木霉JL16)，于2014年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.8807，分类命名为李氏木霉(Trichoderma reesei)。该菌株纤维素酶产率高，遗传稳定性好。 

本发明请求保护的一种李氏木霉菌株，是于2014年1月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.8807的菌株，菌株的名称为李氏木霉JL16。 

所述的李氏木霉JL16，是采用三株纤维素酶高产菌株通过原生质体制备、原生质体分离、原生质体融合、原生质体再生和筛选的制备步骤构建；所述的三株纤维素酶高产菌株，是李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30。 

本发明的李氏木霉JL16的制备方法的技术方案如下所述。 

一种李氏木霉菌株的制备方法，有原生质体的制备、原生质体的融合、原生质体的再生和筛选的过程； 

所述的原生质体的制备，是将李氏木霉菌QM9414、李氏木霉菌MCG77和李氏木霉菌RutC-30分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，得到含有成熟李氏木霉孢子的菌丝；将三株李氏木霉孢子悬液接种至种子培养基中，得到含有抱团菌丝体的李氏木霉；将菌丝体用pH6.5的柠檬酸缓冲液定容，离心，弃上清后重新补加柠檬酸缓冲液并混匀；再分别加入到去壁混合酶液中酶解细胞壁，得到含原生质体的溶液；最后经分离得到白色沉淀的李氏木霉原生质体； 

所述的原生质体的融合，用融合剂将三种白色沉淀原生质体一起吹溶，室温静置10～60min；所述的融合剂，由按下列重量配比的物质组成：20％～80％聚乙二醇(PEG4000)、0.01～0.05M CaCl₂和0.2～1.0M山梨醇；