[发明专利]利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法

权利要求书

1.一种利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在于，按如下步骤进行： 

A.材料的处理 

首先棉花种子经浓硫酸脱绒后，用无菌水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分，粒选饱满、正常发育的种子备用，然后通过沙培的方式培养，将种子植于育苗盘中，28℃培养箱暗培养2d后转至光照培养箱中继续培养，培养条件是12h/d的光照时间，45μmol·m^-2·s^-1的光照强度，温度(30±1)℃。待棉花幼苗长至10d左右，两片子叶完全展开后，分别用300、500和700mg·L^-1的乙烯利涂抹长势一致的幼苗子叶，每天上午10点和下午4点，分别涂抹两次，每个处理选取10株为一组，重复三次，同时对照用蒸馏水处理；经过乙烯利处理5d后，将棉花幼苗的子叶用经过消毒的刀片切下，并保存于－80℃冰箱中备用； 

B.提取步骤A中子叶的基因组DNA； 

C.对所提取的棉花子叶基因组DNA进行双酶切； 

D.对酶切后的DNA模板进行连接； 

E.MSAP预扩增反应； 

F.MSAP选择性扩增反应； 

G.反应产物的电泳检测，特异性条带的回收； 

H.回收条带的纯化、测序； 

I.差异序列的功能分析。 

2.根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在于，所述步骤A中的乙烯利浓度为300、500和700mg·L^-1。 

3.根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在于，所述步骤B中棉花子叶的基因组DNA的提取，采用改良的CTAB法。 

4.根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在于，所述步骤C中双酶切体系为：DNA模板(300-500)ng，(5-10)U EcoRI(Thermo)，2μL10×Buffer EcoRI(500mM Tris-Hcl(pH7.5)， 100mM MgCl₂，1000mM NaCl，0.2％Trition X-100，1mg/ml BSA)，加ddH₂O至20μL，反应混合液在37℃保温(6-12)h，然后65℃水浴20min；再将上一步的酶切产物进行第二步酶切，酶切反应体系(30μL)为，第一步酶切产物20μL，(5-10)U HpaII(或MspI)，3μL10×Buffer Tango(330mM Tris-Ac(pH7.9)，100mM Mg-Ac，660mM K-Ac，1mg/ml BSA)，加ddH₂O至30μL，反应混合液在37℃保温(6-12)h，然后65℃(HpaII)或80℃(MspI)水浴20min，备用。 

5.根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在于，所述步骤D中连接体系为：将双酶切产物，加入(3-5)U T4DNA连接酶(Thermo)，5pmol EcoRI接头，50pmol HpaII/MspI接头，4μL10×T4DNA Ligase Buffer，加ddH₂O至40μL，(21-23)℃连接(8-12)h，产物稀释10倍后备用。 

6.根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在于，所述步骤E中MSAP预扩增反应体系为：(0.5-2)μL的连接产物稀释液，(1.5-3)μL的2.5mM dNTPs，(2-3.5)μL的10×PCRBuffer，(0.5-2)U的Taq DNA聚合酶，预扩增引物E0和H0各(2.5-10)μmol，加ddH2O至25μL。PCR条件为95℃5min；95℃30s，56℃1min，72℃1min，20轮循环；72℃10min，4℃终止。然后把预扩增产物稀释(10-100)倍以备用。 

7.根据权利要求1所述的利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，其特征在于，所述步骤F中MSAP选择性扩增反应体系：(0.5-2)μL的连接产物稀释液，(1.5-3)μL的2.5mM dNTPs，(2-3.5)μL的10×PCR Buffer，(0.5-2)U的Taq DNA聚合酶，选择性扩增引物(E1－E11和H1－H6)各(2.5-10)μmol，加ddH2O至25μL。PCR条件为95℃5min；95℃30s，65℃(每轮循环减少0.7℃)30s，72℃1min，12轮循环；95℃30s，56℃30s，72℃1min，23轮循环；72℃10min，4℃终止； 

以上所用引物组合如下表所示：