[发明专利]利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术分析乙烯利处理对棉花子叶DNA的甲基化水平和甲基化模式变化的影响及衰老相关基因的筛选。 

技术背景

在棉花实际生产中，叶片早衰是导致棉花产量减低的主要因素之一。棉田叶片早衰可导致棉花减产1/5以上，棉花叶片的早衰不但影响了棉花的产量，还导致棉纤维品质下降，进而影响棉纤维的成纱质量。因此，研究棉花叶片衰老，具有重要的理论和实际意义。 

棉花子叶具有生长期长，且当真叶长出后，子叶会自然衰老脱落等优点，在棉花子叶生命周期中，子叶的衰老是一个基因遗传调控的程序化过程，这个过程是伴随着衰老相关基因的表达而发生的。 

DNA甲基化是表观遗传修饰领域的重点内容之一，广泛存在于高等植物中，能够调控基因表达，进而调控植物的生长发育，并在植物处于逆境时发挥重要作用。目前有关DNA甲基化的研究多集中于医学、动物学等领域，而对植物DNA甲基化的相关研究是近些年来开始受到重视，由于DNA甲基化在调节植物生命活动中的重要性，对植物DNA甲基化的研究已经成为表观遗传学研究领域所关注的热点。 

甲基化敏感扩增多态性(methylation-sensitive amplification polymorphism，MSAP)技术是在1997年由Reyna Lopez等人第一次报道，这项技术是在AFLP分子标记技术的基础上衍生出来的，是基于PCR扩增的DNA甲基化多态性的检测方法，即将标准的AFLP分子标记分析中使用的高频酶Mse I，替换成了一对同裂酶Hpa II和Msp I，而此对同列酶对甲基化识别位点敏感性不同，而其余操作与AFLP完全一样。主要操作步骤包括基因组DNA双酶切、人工接头连接、MSAP预扩增反应、MSAP选择性扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳、条带统计分析等。MSAP可以检测在DNA序列没有发生变化时，基因组DNA的甲基化修饰水平，又能够对DNA特异性位点的甲基化状态进行检测。该技术的优点 在于：(1)不需要知道被检测植物DNA的遗传信息，可用于DNA遗传背景未知的生物。(2)操作相对简便，在AFLP技术体系的基础上稍加改进，即可操作。(3)MSAP技术的引物设计简单(4)多态性丰富，可在植物全基因组范围内检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化，因此可提供丰富的甲基,化位点信息。利用该技术，前人研究了多种植物在盐、重金属、干旱、低温胁迫等逆境条件下的DNA甲基化程度和甲基化状态，但关于由乙烯利诱导棉花子叶衰老的基因组DNA甲基化方面的研究还鲜有报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术筛选由乙烯利诱导的白棉子叶衰老相关基因的方法。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

利用甲基化敏感扩增多态性技术筛选白棉子叶衰老相关基因的方法，按如下步骤进行： 

A.材料的处理 

首先棉花种子经浓硫酸脱绒后，用无菌水冲洗干净，并用滤纸吸干表面水分，粒选饱满、正常发育的种子备用，然后通过沙培的方式培养，将种子植于育苗盘中，28℃培养箱暗培养2d后转至光照培养箱中继续培养，培养条件是12h/d的光照时间，45μmol·m^-2·s^-1的光照强度，温度(30±1)℃。待棉花幼苗长至10d左右，两片子叶完全展开后，分别用300、500和700mg·L^-1的乙烯利涂抹长势一致的幼苗子叶，每天上午10点和下午4点，分别涂抹两次，每个处理选取10株为一组，重复三次，同时对照用蒸馏水处理；经过乙烯利处理5d后，将棉花幼苗的子叶用经过消毒的刀片切下，并保存于－80℃冰箱中备用； 

B.提取步骤A中子叶的基因组DNA； 

C.对所提取的棉花子叶基因组DNA进行双酶切； 

D.对酶切后的DNA模板进行连接； 

E.MSAP预扩增反应； 

F.MSAP选择性扩增反应； 

G.反应产物的电泳检测，特异性条带的回收； 

H.回收条带的纯化、测序； 

I.差异序列的功能分析。 

本发明步骤A中的乙烯利浓度为300、500和700mg·L^-1。 

本发明步骤B中棉花子叶的基因组DNA的提取，采用改良的CTAB法。