[发明专利]定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法

权利要求书

1.一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)，在水稻颖壳颜色决定基因OsCHI外显子区选取靶标片段，所述靶标片段的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，其中(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中为碱基A、G、C、T中的任意一个；

2)，按照所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻OsCHI基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框，以及Cas9核酸酶表达框；

3)，将所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，剪切OsCHI基因的双链的所述靶标片段，触发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内OsCHI基因的功能缺失突变；

4)，用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；

5)，通过基因组PCR方法克隆再生植株中OsCHI基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。

6)，选择两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，以筛选出种子变为褐色的再生株系。

2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，X为19或20。

3.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述功能缺失突变为正常OsCHI编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。

4.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表达框能够在水稻细胞内表达，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示；所述Cas9核酸酶表达框能够在水稻细胞内表达，其核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

5.根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表达框包括：水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第1至246位所示；结构特征为(N)_X的靶标序列和人工合成的sgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.1第351至358位所示。

6.根据权利要求4所述的育种方法，其特征在于，所述Cas9核酸酶表达框包括：玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID No.2第1至2031位所示；Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID No.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq ID No.2第6347至6599位所示。

7.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表达框包括CRISPR RNA和sgRNA，所述CRISPR RNA的序列为所述靶标区段的5’-(N)_X-NGG-3’结构中的(N)X或与之互补的序列。