[发明专利]定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法

说明书

技术领域

本发明涉及水稻生物技术育种领域，具体涉及一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的育种方法。

背景技术

水稻颖壳颜色是一种在水稻抽穗后就能识别的标记，研究表明颖壳颜色受到多种因素影响，与环境因素、木质素合成以及类黄酮类色素的积累和沉积等有关，其中颖壳中类黄酮色素的积累是造成多种颖壳颜色的主要原因。水稻颖壳颜色受环境因素影响较小，性状较为稳定，是水稻分类、育种和品种区分的重要标记形状。

国内外对颖壳颜色的遗传研究由来已久。水稻颖壳颜色的遗传既有受单基因控制的，也有受2～3对互作基因控制的。OsCHI是一种可单独控制水稻颖壳颜色的基因。OsCHI编码一种查尔酮异构酶，可催化柚皮苷查尔酮异构化形成有生物活性的二羟基黄烷酮，是色素合成途径中将中间体查尔酮转化为最终产物花青素等水溶性色素的关键步骤。已有报道表明，籼稻品种浙辐802的突变体gh1中，OsCHI基因5’非翻译区中，在翻译起始密码子ATG上游12bp处，插入了一个长达7.3kb的反转座子，造成OsCHI基因不表达，从而引起gh1突变体的颖壳颜色变深。进一步的分析表明，OsCHI基因的不表达，仅造成水稻种子颖壳和节间颜色的加深，并不会改变花期、产量、米质等主要水稻农艺形状。

虽然OsCHI在品种区分等方面具有广阔的应用前景，但是其天然的遗传突变资源有限，应用存在一定的技术难度。通过传统的回交导入技术，育种周期漫长，成本较大，且可能导入与突变位点连锁的其他供体基因组片段，对品种选育带来不可预知的风险。因此，人们希望通过找到更好地方式创制褐壳水稻材料。但是目前，还没有研究机构在这方面取得突破。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种定向编辑颖壳颜色决定基因OsCHI创制褐壳水稻材料的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)，在水稻颖壳颜色决定基因OsCHI(LOC_Os03g60509.1)外显子区选取靶标片段，其中所述靶标片段位于目的基因(水稻颖壳颜色决定基因OsCHI)上，所述靶标片段的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N为A、G、C、T中的任意一个；

2)，按照所述靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻OsCHI基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框包括CRISPR RNA(crRNA)和sgRNA，CRISPR RNA的序列为所述靶标区段的5’-(N)_X-NGG-3’结构中的(N)_X或与之互补的序列；

3)，将所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在细胞中共同表达，剪切OsCHI基因的双链靶标片段，触发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内OsCHI基因的功能缺失突变；

4)，用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；

5)，通过基因组PCR方法克隆再生植株中OsCHI基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。

6)，选择两个等位OsCHI基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，以筛选出种子变为褐色的再生株系。

所述靶标片段位于OsCHI基因外显子上，优选为OsCHI基因第一外显子和第二外显子。在所述OsCHI基因外显子上，具有所述(N)_X-NGG-3’结构的片段可选为靶标的共有71个，优选的，靶标片段选自位于第一外显子的13个或位于第二外显子的15个具有所述(N)_X-NGG-3’结构的片段。选择其他外显子的效果不如此二者。

在一种实现方式中，X为19或20。本申请的发明人发现只有当X为19或20时，所得的实验结果才最为理想，其他数值均难以是实现相同效果。

所述功能缺失突变为正常OsCHI编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。