[发明专利]一种铁皮石斛的单倍体育种方法

说明书

技术领域

本发明属于单倍体育种领域，尤其涉及一种铁皮石斛的单倍体育种方法。 

背景技术

铁皮石斛是我国常用传统中药，具有养胃生津、滋阴清热等独特功效。在唐代医学经典《道藏》中，铁皮石斛被列为“中华九大仙草之首”，自唐宋以来，一直被列为皇室贡品。近年来大量深层次的研究开发发现铁皮石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、扩张血管及抗血小板凝集等作用。因此人们对铁皮石斛的需求量大大增加，由于人们长期无限制，掠夺性和毁灭性的采挖，再加上石斛属的物种在自然界结实率低，种子因无胚乳，萌发率5％以下。铁皮石斛的国内自然野生资源已经枯竭，现已被国家列为二级保护植物。现有石斛生产企业盲目追求生产种苗速度，在品种选育上盲目选择产量高，生长快的品种进行种植。其品种抗病、抗逆行差，容易受到病害的侵袭。发病后用农药进行防治，这样生产的铁皮石斛药用价值低，甚至还有农药残留，远不能与野生的铁皮石斛相比。难以保证铁皮石斛的药用质量。严重阻碍了石斛行业的可持续性发展，石斛野生品系的保存和优质品种的开发迫在眉睫。 

随着植物组培技术的发展，植物细胞具有“全能性”得到了广泛的证实，因此，在离体条件下用离体的方法培养花药，人为的改变小孢子的发育途径，使其配子体发育途径终止，转向孢子体发育，通过 器官发生或胚发生的途径，形成完整的单倍体植株，为人工大量生产单倍体提供有效的手段。通过这一途径再生的单倍体植株，经自发加倍或者人工诱发加倍，获得纯合二倍体植株，从而为进一步的育种和遗传研究提供有用材料。利用花药花粉培养获得单倍体进行育种是植物育种技术上的一项重大改革，它可以与目前所采用的杂交育种，人工诱变育种，远缘杂交育种的方法结合，用以克服这些方法中的一些不足，也可以直接用此法创造新的类型。利用花药培养产生单倍体植株的方法已经在许多具有经济价值和观赏价值的植物上取得了成功，这不但为植物育种手段增添了一项新内容，同时也使园艺植物的有效性进一步在遗传上得到加强。因为单倍体只含有一套染色体，这套染色体存在着所有基因，所以即使隐性基因也能在表型中的到表达。加倍的单倍体容易获得纯合且能育的二倍体，这就使得一些天然的基因得到有效的保存。 

发明内容

本发明为了解决上述现有技术存在的缺陷和不足，提供了一种可以改良铁皮石斛品种，同时可以选育铁皮石斛新品种的铁皮石斛的单倍体育种方法。 

本发明的技术方案：1.一种铁皮石斛的单倍体育种方法，包括下述步骤： 

a.取铁皮石斛开花3-6天的花朵，培养前在常温下接种花粉后在低温4℃的花药愈伤组织诱导培养基中处理45-50小时，再进行常规培养； 

b.用浓度为5％-6％的NaCIO溶液灭菌15分钟，无菌水冲洗5次，将消毒后的花蕾在无菌环境下剥出花药，尽量防止花药受到伤害，接种于花药愈伤组织诱导培养基中，用保鲜膜封口； 

c.在25℃下进行黑暗恒温培养，2-3天，再在进行黑暗震荡培养12-15天，得到胚状体； 

d.收集胚状体，接种至分化培养基，再在组培室中光照培养12小时/天，温度控制在24-26℃；待植株发育良好，开盖炼苗5天；炼苗后移入营养基质中培养，得到单倍体植株； 

e.用秋水仙碱对单倍体植株的根系进行加倍处理，利用流式细胞仪对所有幼苗新长出的叶片进行倍性分析，如果是单倍体则进行秋水仙碱加倍处理；植株恢复正常后移入大田进行正常栽培。 

本发明采用铁皮石斛成熟的花粉进行培养。铁皮石斛的花为总状花序，常从落了叶的老茎上部发出，具2-3朵花；花序柄长5-10毫米，基部具2-3枚短鞘；花序轴回折状弯曲，长2-4厘米；花苞片干膜质，浅白色，卵形，长5-7毫米，先端稍钝；花梗和子房长2-2.5厘米；萼片和花瓣黄绿色，近相似，长圆状披针形，长约1.8厘米，宽4-5毫米，先端锐尖，具5条脉；侧萼片基部较宽阔，宽约1厘米；萼囊圆锥形，长约5毫米，末端圆形；唇瓣白色，基部具1个绿色或黄色的胼胝体，卵状披针形，比萼片稍短，中部反折，先端急尖，不裂或不明显3裂，中部以下两侧具紫红色条纹，边缘多少波状；唇盘密布细乳突状的毛，并且在中部以上具1个紫红色斑块；蕊柱黄绿色，长约3毫米，先端两侧各具1个紫点；蕊柱足黄绿色带紫红色条纹， 疏生毛；药帽白色，长卵状三角形，长约2.3毫米，顶端近锐尖并且2裂。随着花的成熟，黄颜色会渐渐加深。从而选取开花3-6天的花药进行培养。 

本发明方法在胚状体诱导过程当中，对花蕾进行了低温诱导，提高了胚状体发生频率和胚成活率，其胚成活率高达95％以上。