[发明专利]一种提高α-葡萄糖基化丁香酚产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用大孔吸附树脂固定丁香酚，通过野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243发酵液催化固定化的丁香酚和游离的麦芽糖制备α-葡萄糖基化丁香酚的方法。

背景技术

此丁香酚具有抑菌、麻醉、解热、抗氧化、抗肿瘤、促进透皮吸收、驱蚊等多种药理活性。但在实际应用中往往有不溶于水，不稳定，置露空气下变黑稠黏，有刺激臭等不良性质的限制。因此，在保留其活性前提下，对其进行结构改造，从而改变不良物理性质，扩大其应用范围。

近几年的研究表明，通过葡萄糖基化靶向性的改造酚类化合物，不但可以改变其不良的物理性质，例如难溶于水，有酸苦味和刺激性气味等，更能提高其生物活性和使用安全性，从而扩大酚类物质的使用范围。

然而作为反应底物的丁香酚具有抑菌作用，丁香酚通过作用细胞膜，使细菌溶解死亡。因而在反应体系中只能加入少量的丁香酚，因此，研究一种可以大量的加入丁香酚又不会造成抑菌的方法，是大规模生产α-葡萄糖基化丁香酚的前提条件。

大孔吸附树脂具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，已在环保、食品、医药等领域得到广泛应用。在此将其作为固定化丁香酚的载体，在反应中起到两个重要作用：一、减少丁香酚的杀菌作用。二、提高反应液中丁香酚的添加量。

日本学者Toshiyuki Sato通过野油菜黄单胞菌WU-9701的粗酶液成功糖基化改造了多种物质，例如咖啡酸、薄荷醇、儿茶素、对苯二酚等等，并首次使用丁香酚和麦芽糖转化制得了α-葡萄糖基化丁香酚。但此方法提取酶过程较繁琐，且反应体系小，实际生产规模中很难采用此法。

国内张鹏、陈畅、汪盈、苑丽辉等也通过生物转化法制得α-葡萄糖基化丁香酚。分别采用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的菌体发酵液和提取了黄单胞菌中的酶来参与糖基化反应。但这两种方法均存在以下问题：

一、菌体或酶对丁香酚的耐受程度不高，导致产量不高；

二、丁香酚易挥发，在反应过程中浓度越来越小；

三、α-葡萄糖基化丁香酚的转化率不高，尤其是麦芽糖的利用率极低；

四、丁香酚的加入方式容易导致菌体直接致死而转化失败。

为了解决上述问题，减少底物（丁香酚）抑制是最好的解决办法。通过用树脂将丁香酚固定的方式，使其在发酵液中游离的浓度降低至基本为零，从而减少丁香酚的挥发，而菌体的生长代谢不受影响，可以更好的催化合成α-葡萄糖基化丁香酚；由于消除了底物抑制，可以提高单位体积发酵液中的丁香酚的浓度；此外发酵液中几乎不存在游离丁香酚，可以减少起保护作用的麦芽糖添加量；最后反应结束后，产物与反应物均在树脂上，简化了后续产物分离纯化工艺。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的一些缺陷，利用树脂固定丁香酚，从而减少丁香酚的抑菌作用，提高单位体积发酵液内的丁香酚浓度，进而提高α-葡萄糖基丁香酚的产量。用野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243发酵液催化固定化的丁香酚，在最佳反应条件下催化合成α-葡萄糖基化丁香酚。该方法消除了丁香酚在游离发酵液中的抑菌作用，大大减少了麦芽糖的添加量，简化了产物后续分离纯化的工艺，大大降低了操作导致的转化失败的风险，具有产量高、成本低、工艺简单、操作安全等优势，为大规模生产α-葡萄糖基化丁香酚奠定了基础。

本发明的整体技术构思是：

利用树脂固定丁香酚作为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243催化合成α-葡萄糖基化丁香酚的反应物，该方法由下列工艺步骤组成：

(1) 树脂固定化丁香酚的制备；

(2)野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243斜面种子的制备和液体发酵；

(3)加入麦芽糖和树脂固定的丁香酚进行反应；

(4)α-葡萄糖基化丁香酚的分离纯化

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是：

步骤（1）中固定化丁香酚的制备：