[发明专利]用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物及其扩增引物和应用

权利要求书

1.一种用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物，其特征在于所述的分子标记物的基因片段如下：分子标记物miR-137基因片段的核苷酸序列为5’-UAUUGCUUGAGAAUACACGUAG-3’，分子标记物miR-2008基因片段的核苷酸序列为5’-AUCAGCCUCGCUGUCAAUACG-3’。

2.一种用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物扩增引物，其特征在于：扩增权利要求1所述的miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列为：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增权利要求1所述的miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列为：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3，扩增RNU6B内参基因的正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。

3.一种用于刺参腐皮综合症早期诊断的试剂盒，其特征在于包括权利要求2所述的扩增miR-137基因片段的正向引物：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’、扩增miR-2008基因片段的正向引物：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3以及扩增RNU6B内参基因的正向引物：5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。

4.一种利用权利要求1所述的刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物的检测方法，其特征在于步骤如下：

a、总RNA的提取：取刺参体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入RNAiso-plus试剂（购于Takara公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm, 离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm, 离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1mL， 4℃，12000rpm, 离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液； 

b、cDNA合成：取500ng上述RNA提取液用miScript 反转录试剂盒（Qiagen, Germany）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；

c、PCR扩增：利用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行（Qiagen, Germany），20ul扩增体系：SYBR Green混合液10.0ul，引物溶液1ul，cDNA溶液1ul，ddH₂O 补充至20ul ；扩增反应条件：95℃ 15 min，94℃ 15s，60℃ 30s，70℃ 30s，共40个循环，反应完成后进行熔解曲线分析；其中引物溶液包括扩增miR-137基因片段的正向引物：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增miR-2008基因片段的正向引物：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3’、 扩增miR-137基因片段和miR-2008基因片段的反向引物为通用引物，各引物浓度均为10uM，内参基因为RNU6B，扩增RNU6B内参基因用正向引物为5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’，反向引物为通用引物；

d、鉴定：扩增完成后，利用2^-△△CT方法分析基因表达量，若miR-137基因片段和miR-2008基因片段同时高水平表达，且表达倍数高于2.3则认为刺参处于腐皮综合症发病早期。