[发明专利]用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物及其扩增引物和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物及其扩增引物和应用。

背景技术

刺参（Stichopus japonicus Selenka）隶属于棘皮动物门，刺参纲，楯手目，俗称海老鼠和海黄瓜。主要分布在我国大连、北戴河、山东半岛、江苏连云港及平山岛等沿海。伴随着刺参养殖产业的发展，以腐皮综合症为代表的病害问题逐渐成为制约产业发展的重要瓶颈。据不完全统计，2004-2013年由于病害造成的刺参产业经济损失每年30-40亿元。因此，构建以新型疾病响应分子标记物为核心的疾病预警系统是提高刺参产业经济效益的前题，是开展分子诊疗的基础。

microRNA(miRNA)是一类高度保守的，长约22nt的非编码小分子RNA，这类小分子广泛存在于动植物中并参与了包括细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等在内的多种生物学过程。miRNA可通过在转录或转录后水平上调控基因的表达来实现其相应的生物学功能，在多种疾病的发生和发展过程中扮演了极其重要的角色，因此，miRNA不但可以成为预测某些疾病发生的分子标记物而且还有可能成为治疗某些疾病的分子靶点。越来越多的研究证明，miRNA作为一种调控因子其表达水平的改变和多种疾病过程相关，目前以miRNA作为分子标记物的检测手段已被广泛应用于肺癌、乳腺癌以及糖尿病等疾病的早期诊断中。

刺参腐皮综合症由于其发病率高、传染快速、死亡率高且病原复杂等特征，使其难以得到快速的诊断和治疗，因此通过方便快捷的现代生物学技术检测来诊断刺参腐皮综合症具有重要意义。目前，国内外还没有公开任何关于利用miRNA分子作为刺参腐皮综合症发病早期预测或诊断的分子标记物来诊断刺参腐皮综合症的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用miRNA分子作为刺参腐皮综合症发病早期诊断的分子标记物，并提供用于刺参腐皮综合症发病早期诊断的分子标记物扩增引物。本发明还提供了利用该分子标记快速预警刺参腐皮综合症发生的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物，所述的分子标记物的基因片段如下：分子标记物miR-137基因片段的核苷酸序列为5’-UAUUGCUUGAGAAUACACGUAG-3’，分子标记物miR-2008基因片段的核苷酸序列为5’-AUCAGCCUCGCUGUCAAUACG-3’。

扩增权利要求1所述的miR-137基因片段的正向引物的核苷酸序列为：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’， 扩增权利要求1所述的miR-2008基因片段的正向引物的核苷酸序列为：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3，扩增RNU6B内参基因的正向引物的核苷酸序列为：5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。

一种用于刺参腐皮综合症早期诊断的试剂盒，包括权利要求2所述的扩增miR-137基因片段的正向引物：5’-TATTGCTTGAGAATACACGTAG-3’、扩增miR-2008基因片段的正向引物：5’-ATCAGCCTCGCTGTCAATACG-3以及扩增RNU6B内参基因的正向引物：5’-CGTGAAGCGTTCCATATTTTAA-3’。

一种刺参腐皮综合症早期诊断的分子标记物的检测方法，步骤如下：

a、总RNA的提取：取刺参体腔液1.0mL，800g离心5min，收集血细胞，加入RNAiso-plus试剂（购于Takara公司）1.0mL，震荡混匀，室温放置5min，再加入0.2mL氯仿，震荡混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm, 离心15min，吸取上清至PE管中，加入该上清等体积的异丙醇，混匀，室温静置5min，4℃，12000rpm, 离心10min，去上清，在沉淀中加入质量百分浓度为75%的乙醇1mL， 4℃，12000rpm, 离心5min，去上清，沉淀静置5-10min，加20μL无RNA酶水，得到RNA提取液； 

b、cDNA合成：取500ng上述RNA提取液用miScript 反转录试剂盒（Qiagen, Germany）合成，得到cDNA，具体合成方法依cDNA合成试剂盒说明书进行；