[发明专利]菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域，具体为：本发明涉及一种检测鉴定菊花及其产品中是否携带菊花花枯病菌(Didymella ligulicola)的实时荧光PCR方法。

背景技术

菊花花枯病Didymella ligulicola是菊花上的重要病害。1982年被列入EPPO检疫性有害生物A2名单中，属于我国的检疫性病害。该病于1904年，美国的北卡罗那州首先发现并报道；随着菊花切花和盆栽菊花的大量生产，危害日益严重，英、德、荷兰、丹麦、加拿大、肯尼亚、坦桑尼亚、日本、澳大利亚、新西兰等国均有发生，我国目前尚无报道发生。

该病主要侵染菊花花冠，流行快，几天之内可使花冠完全腐烂；也可以使切花在运销过程中大量落花，给商品菊花造成很大的损失。而且该病对环境适应能力很强，可以在各种恶劣自然条件下发生，尤其在温室中，常年都可以发病，因此该病一旦定殖，将会对我国的菊花产业带来毁灭性的打击，即使花费大量的人力和财力，也很难得到根治。

目前我国菊花出口的势头较好，菊花是日本人祭祀祖先的专用花。由于日本国内生产鲜切菊花成本高，菊花种植面积逐年减少，日本每年从我国大量进口鲜切菊花。北京、上海、江苏、浙江、广东直至海南生产的鲜切菊花都开始出口，1996年至2006年，我国出口到日本的鲜切菊花总量有3000多万枝，为我国花卉企业带来了很好的收益。

鉴于该病危害性严重、适应性强，且我国尚无分布，加强检疫是防止该病害传入我国的首要手段，但鉴于切花产品的特殊性，检疫周期的长短直接影响着切花产品的品质，传统的检疫手段耗时长、难度大，并且无法从无症状植株上检出该病，因此筛选一种适宜、准确、快速的检疫鉴定方法，已成为我国菊花生产，及其他菊科作物的进出口上亟待解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种实现对菊花花枯病菌进行快速检测的菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法，以待测样品DNA为模板，利用上游引物DL1、下游引物DL2和荧光探针Probe-DL进行PCR扩增，若发生特异性扩增，则表明待测样品中带有菊花花枯病菌D.ligulicola；

所述上游引物DL1为：5，-CAACACTTAAACCCTTTGTAATTGA-3，

所述下游引物DL2为：5，-GGACGTCGTCGTTTTGTTGT-3，；

所述荧光探针Probe-DL为：5，-FAM-ACAACTTTCAACAACGGATC-TAMRA-3，。

作为本发明的菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法的改进：

所述PCR扩增的反应体系(20μL)为：

所述PCR扩增的反应条件为：

50℃预热2min，95℃变性10min；然后进入40个循环，95℃15s，60℃1min。

作为本发明的菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法的进一步改进：PCR扩增扩增后读取Ct值，当Ct值为小于或等于36时，判定为发生特异性扩增，即表明待测样品中带有菊花花枯病菌D.ligulicola。

作为本发明的菊花花枯病菌实时荧光PCR检测方法的进一步改进：所述待测样品为菊花及菊花产品。菊花产品包括菊花切花、菊花切条、干制菊花茶等。

本发明的技术方案具体如下：

1、引物和探针的设计

在NCBI的网站上(http://www.ncbi.hlm.nih.gov/BLAST/)选取了18个分别来自Didymella及Phoma属真菌的rDNA的内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列，用MegAlign软件(version5.0；DNASTAR,Madison,WI)的ClustalV算法进行排序。在排序后的在变异区域特设了菊花花枯病菌的特异性引物和探针。引物探针序列见表1。

2、引物探针特异性的理论验证

为了验证探针的特异性，用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)对引物探针进行了验证。BLAST搜索发现，所设计的引物和探针具有较高的特异性。发现该对引物只能扩增菊花花枯病菌。(其中Stagonosporopsis ligulicola为Didymella ligulicola的异名。)

经过BLAST验证，所设计的引物探针理论上具有很高特异性。

表1