[发明专利]利用四环素调控的dcf1基因诱导表达系统及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用四环素调控的dcf1基因诱导表达载体及其构建方法。

背景技术

树突状细胞因子（Dendritic Cell Factor，DCF1）又被称为跨膜蛋白59（Transmembrane Protein59，Tmem59）。最早是在树突状细胞中发现而因此得名的，其被认为是一种在DC分化和迁移的过程中起作用的信号分子。根据本实验室前期的工作，在未分化的神经干细胞与分化的神经细胞内发现了12个存在高度差异表达的序列表达标签（Express Sequences Tag，EST），其中编号SHD11的序列与小鼠EST BG172336有91%的同源性，其包含117个氨基酸的开放阅读框，蛋白序列分析表明其与DFC1有98%的同源性。接下来的研究又发现，在小鼠神经干细胞系C17.2中过表达DCF1，可维持神经干细胞状态，而RNAi沉默DCF1表达，可引起C17.2神经干细胞进入分化状态，主要向胶质细胞分化（10%星形胶质细胞，1%神经元）。通过小分子MicroRNA-351下调DCF1表达时，C17.2神经干细胞也向胶质细胞分化。而且通过之前构建的荧光载体pEGFP-DCF1，发现在U251胶质瘤细胞系中过量表达dcf1基因，可显著抑制U251细胞增殖、迁移、侵袭能力。

Gossen和Bujard最先描述了一种适用于哺乳动物细胞的四环素（Tetracycline, Tc）调控基因表达系统，可根据需求控制外源基因在细胞中的表达量和表达时间。四环素调控系统根据实验需求可分为Tet-off和Tet-on两种，其中Tet-off调控系统通过加入四环素或者强力霉素（Doxycycline, Dox）来停止基因的表达，而相反地，Tet-on系统则是在加入了四环素或强力霉素后基因才开始表达。我们根据实验需求，选择了构建Tet-on系统来调控dcf1的表达。该系统包含两部分：四环素控制的转录抑制子（tetracyline-controlled transcriptional suppressor, tTS）与含有四环素反应原件的人巨细胞病毒启动子（P_TREmod/cmv）。tTS是一个很强的转录抑制子，是四环素抑制子蛋白（tet repressor protein, TetR）与Kid-1蛋白的KRAB-AB沉默区域（SDKid-1）的融合蛋白。P_TREmod/cmv主要部分为四环素反应原件（Tet response element, TREmod），由7段重复的36bp碱基构成，每段36bp碱基中包含一段19bp的四环素操纵子序列（tet operator sequence, tetO）。

发明内容

    本发明的目的之一在于克服现有技术中存在的问题，提供一种利用四环素调控的dcf1基因诱导表达载体。

    本发明的目的之二在于提供该载体的构建方法。

    为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用四环素调控的dcf1基因诱导表达载体，其特征在于该载体为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种构建上述的利用四环素调控的dcf1基因诱导表达载体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.    以pSIREN-RetroQ-TetP为模板，用PCR酶扩增出长为330bp的 TREmod；所述的酶扩增所用引物序列如下，下划线部分为AseI酶切位点：

上游引物：5’-TTATCCATTAATCACTCCTTCTCTAG-3’；

下游引物：5’-TCAAGTTACATTAATCATATGACCT-3’；

b.    将步骤a所得TREmod片段割胶回收，酶切出粘性末端后，用碱性磷酸酶脱磷处理，再连接到载体pEGFP-DCF1的CMV启动子前的AseI位点中，即得到利用四环素调控的dcf1基因诱导表达载体。

本发明利用四环素调控系统的原理，结合DCF1表达载体pEGFP-DCF1，构建了一个全新的DCF1调控系统，该系统可以在特定空间和时间诱导表达DCF1 基因，有助于更好地研究DCF1基因的功能，具有调节效率高、无副作用、反应讯速等特点。

附图说明

图1载体pTRE-EGFP-DCF1构建示意图