[发明专利]一种无引物的基因合成方法

权利要求书

1.合成基因用的pNew载体质粒，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示。

2.一种构建权利要求1所述pNew载体质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示的线性载体骨架pNew；

扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.27所示的抗性基因片段5SGCK以及核苷酸序列为SEQ ID NO.32所示的3KCGS；

将线性载体骨架pNew、抗性基因片段5SGCK和抗性基因片段3KCGS克隆到一个完整的载体上，即得。

3.用权利要求1所述的pNew载体质粒构建得到的载体库。

4.按照权利要求3所述的载体库，其特征在于：包含有16384个质粒。

5.按照权利要求4所述的载体库，其特征在于：载体库中的每个质粒包含有任意7个碱基对的任一排列组合序列。

6.一种无引物的基因合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将预合成的目标基因DNA序列进行分组；

(2)将依次命名的小片段分别在权利要求3所述的质粒库中找到对应的质粒；其中，每个82bp的片段需要16个带有7bp碱基的质粒；

(3)将查找得到的对应的质粒分别用AgeI、BsgI和XmaI、BseRI酶切，用Kana(卡纳霉素)抗生素进行遗传筛选，得到含12bp目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BsgI、SalI和BseRI、XhoI酶切，用相应的Cam(氯霉素)抗生素进行遗传筛选，得到含22bp目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BsgI、BamHI和BseRI、BglII酶切，用相应的Gem(庆大霉素)抗生素进行遗传筛选，得到含42bp目的基因序列的质粒；将对应的质粒分别用BsgI、SpeI和BseRI、XbaI酶切，用相应的Spc(壮观霉素)抗生素进行遗传筛选，得到含82bp目的基因序列的质粒；

(4)要合成大于82bp以上的DNA片段，用XG1、XG2、XG3、XG4、XG5……质粒作为供体质粒，再另加切好的受体载体质粒puc-Kana，做金门克隆反应，通过金门克隆反应能够将基因片段拼接成完整基因。

7.按照权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：预合成的目的基因按每个片段82bp进行分组。

8.按照权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：目的基因分组后的每个片段之间有3个碱基的重复。

9.按照权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：金门克隆受体载体puc-Kana有gfp表达盒式结构和kana抗性基因。

10.按照权利要求6所述的基因合成方法，其特征在于：如果目的基因比较大，则进行第二轮金门克隆以合成较大片段的目的基因直至合成所需要的目的基因。