[发明专利]一种无引物的基因合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因合成方法，尤其涉及一种基于库的无引物基因合成方法，属于基因合成技术领域。

背景技术

近年来合成生物学，特别是基因合成技术的研究进展非常迅速。目前，全基因合成是依照某一蛋白质的核苷酸序列，首先设计合成相互重叠的单链寡核苷酸，再通过重叠延伸PCR法拼接出全长的基因序列，在此基因合成过程中无需模板，是目前获取基因的有效手段之一。

迄今为止，已经报道的基因合成方法都是依赖于化学合成的寡核苷酸引物，主要包括以下几种方法：(1)化学合成法，由于化学合成法的原理本身存在着一定程度的缺陷，这些缺陷决定了化学法合成的DNA片段不可能太长，化学合成法主要用于寡核苷酸的合成；(2)PCR介导的合成方法，这种方法可以合成大的DNA片段，而且周期也比较短，但PCR介导的合成方法错误率比较高，对于合成大于2kb以上的DNA其错误率更高，因此为了得到大的DNA片段的正确克隆，可能需要多次克隆和测序的重复工作，这样会额外的增加基因合成的成本，而且由于是PCR介导的方法，需要DNA高温聚合酶和dNTP等试剂，这样也会增加基因合成的成本；(3)非PCR介导的方法，到目前为止报道的基于非PCR的DNA合成方法主要是DNA的固相合成技术。这种固相合成技术，其合成的错误率大大降低，但是由于在合成过程中需要使用经过特殊修饰的引物，这样就会导致引物的成本增加，从而导致后续基因合成的成本增加。同时，固相合成技术依赖特殊的仪器设备，无法满足普通实验室和科研单位的需求。

随着合成生物学的研究进展，特别是基因合成技术方法研究的不断深入，目前急需开发一种新的基因合成方法，建立一种能够以相对低廉的价格，在短时间内准确和高效的合成长片段基因的方法，以解决现有基因合成技术中存在的错误率高，合成成本高等问题。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种无引物的基因合成方法；

为实现上述目的，本发明首先提供了一种用于基因合成用的pNew载体质粒；其核苷酸序列为SEQ ID NO.33所示；

本发明进一步提供了一种构建所述pNew载体质粒的方法，该方法包括：

(1)构建获得核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示的线性载体骨架pNew；

(2)扩增核苷酸序列为SEQ ID NO.27所示的抗性基因片段5SGCK以及核苷酸序列为SEQ ID NO.32所示的3KCGS；

(3)将线性载体骨架pNew、抗性基因片段5SGCK和抗性基因片段3KCGS克隆到一个完整的载体上，即得所述pNew载体质粒。

本发明以pet23a质粒为模版，以ori-PF/ori-PR为引物，通过PCR扩增得到线性载体骨架pNew(1.9kb)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.21所示；在PCR过程中通过引物ori-PR引进限制性内切酶BseRI的识别位点。

本发明分别以质粒RNALIC、pDEST32、pet28b和pet23a为模板，设计引物，通过PCR扩增5Spc片段(656bp)、5Gem片段(535bp)、5Cam片段(371bp)、5Kana片段(556bp)和Amp盒式结构(969bp)，扩增的上述片段5’或3’端分别引入了适宜的限制性酶切位点；每个片段之间都引入了18-20bp的同源序列，再把这几个片段逐次做重叠延伸PCR，即通过引物5Spc-PF和5Gem-PR扩增将5Spc片段和5Gem片段连接；通过引物5Spc-PF和5Cam-PR扩增将5Spc5Gem片段与5Cam片段连接；通过引物5Spc-PF和5Kana-PR扩增将5Spc5Gem5Cam片段与5Kana片段连接；通过引物5Spc-PF和Amp-PR扩增将5Spc5Gem5Cam5Kana片段与Amp盒式结构连接得到一个大片段5SGCK(3kb)，其核苷酸序列为SEQ ID NO.27所示。