[发明专利]全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺及产品

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗的制备方法及产品，尤其涉及全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺以及由此工艺获得的产品。

背景技术

目前，禽流感灭活疫苗及其他动物流感疫苗的生产主要依靠传统的“鸡胚法”工艺实现。“鸡胚法”制取疫苗的技术由来已久，最初于20世纪50年代开发，工人将病毒注入鸡胚中，让病毒伴随鸡胚的发育自然繁殖，等鸡胚发育3天左右，工人要把一个个蛋壳打开，逐个收集抗原，一般来说，生产一批疫苗的抗原往往需要几万枚鸡蛋，工作量大。虽然目前以鸡蛋制取疫苗的工艺经过发展演变，已经不再是一个完全人工的操作过程，但很多生产环节依然无法超越人工介入的局限性，潜在的高污染风险、抗原产量低、生产周期长等方面也亟待改观。此外，在实际的生产过程中，“鸡胚法”除去技术本身存在缺陷，还有一个值得关注的焦点就是SPF鸡胚供应量的制约以及成本问题，大多数的禽流感灭活疫苗并非全部由SPF鸡胚制造，而是用普通鸡胚生产的灭活疫苗，由于卵黄抗体的存在导致的抗原量不足，直接影响疫苗的质量，常常会造成免疫失败。

当前，在技术改进方面，反应器细胞悬浮培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。在我国，农业部公告第1708号中明确规定，自2012年2月1日起，各省级兽医行政管理部门停止转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。该公告对动物疫苗生产技术升级做出了强制性规定。细胞悬浮培养工艺技术在疫苗生产中的应用不仅能提高疫苗抗原产量，缩短疫苗生产周期，降低生产成本，而且规模化、自动化的反应器疫苗生产平台有效保证每批疫苗质量的稳定性和可靠性。

细胞悬浮培养根据细胞是否贴壁分为无载体的悬浮细胞培养(全悬浮)和贴壁细胞微载体悬浮培养。细胞微载体悬浮培养即细胞贴附在微载体上，再借助搅拌系统悬浮在培养液中培养。载体培养本质上还是贴壁培养，技术难度低，适用于难以驯化为全悬浮的细胞，而且载体培养在成本、细胞密度、操作简便性和工业放大等方面有重大的先天缺陷，其最大培养体积不超过300升，这限制了该技术的大规模化应用。而大规模化是生物反应器的根本优势，1000升以上的培养规模才能充分发挥其规模效应，小于此培养规模的生产线在人力成本、污染风险方面相比传统转瓶技术无明显提高。

近来，研究发现MDCK细胞对禽流感病毒敏感，经过培养优化，病毒滴度高于鸡胚。如现有技术中的发明专利ZL201010159741.6，其公开了一种H9N2亚型禽流感灭活疫苗的制备方法及产品，其技术要点主要涉及病毒适应细胞系的筛选、确定、驯化，病毒适应细胞的初级扩增培养和连续培养、接种病毒培养制备病毒液以及最终的灭活及疫苗产品的制备，主要采用微载体技术悬浮培养MDCK细胞生产禽流感灭活疫苗。但受载体放大工艺等限制，其无法满足规模化工业化生产优质禽流感灭活疫苗的需求。

发明内容

本发明的一个目的是，针对现有技术存在的问题，提供全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，满足规模化工业化生产的需要，并且，保证所生产的禽流感灭活疫苗在安全性及效力等方面均表现为优质。

本发明的另一个目的在于，提供一种禽流感灭活疫苗产品，该产品利用全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺进行生产，制得的产品在安全性及效力等方面均有高质表现。

本发明解决问题的技术方案是：提供全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，包括如下步骤：

(1)全悬浮培养MDCK细胞；

(2)利用步骤(1)培养的MDCK细胞全悬浮培养生产禽流感病毒；

(3)禽流感病毒液的澄清、灭活、除菌、浓缩纯化；

(4)将收获的病毒液乳化制成疫苗成品。

进一步地，按照本发明的全悬浮培养细胞制造禽流感灭活疫苗工艺，在步骤(1)中，所述的全悬浮培养MDCK细胞，通过以下培养条件制得：全悬浮MDCK细胞以0.5×10⁶个/ml的密度接种生物反应器，MDCK细胞培养温度为36～37℃，pH值为6.8～7.2，溶氧为40％～70％。