[发明专利]一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺。 

背景技术

Flufuran由Gabriela M. Cabrera等人于2002年首次从Polyporus ciliatus中分离得到(Gabriela M.; Robertia M.; Jorge E.; Alicia M. Phytochem.2002,61,189-193.)。Antonio Evidente等人于2009年从Aspergillus flavus中再次得到，并发现该化合物具有显著的抗疫霉菌活性(Antonio E.; Gennaro C.; Biancavaleria P.; Anna A.; Antonino T.; Dominique M. Chem. Biodivers.2009,6,328-334.)。此外，该化合物的类似物如2-四氢呋喃甲酸等被大量用于医药中间体。 

上述文献中，Flufuran的发酵产量是0.625 mg/L和43.7 mg/L，且分别需要培养15 d和14 d。因此，低产量是该化合物进行全面活性评价以及开发应用的限制因素。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，该方法可快速、高效制备高纯度的Flufuran。 

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海洋青霉菌，该菌分类命名为Penicillium dipodomyicola，于2014年3月保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014087。 

该菌落在培养初期呈现淡黄色，随着培养时间延长，菌落颜色不断加深至褐色，分生孢子较松散的分布在菌体上，在培养后期可见孢子脱落。 

一种海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，包括以下步骤： 

（1）菌种活化

将保藏在-80℃冰箱中的保藏编号为CCTCC M 2014087的海洋青霉菌接种在马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基（PDA）上，在25 ℃培养箱中培养2 d后，挑取单菌落再次接种到PDA培养基上，再于25 ℃培养箱中培养2 d后备用；

（2）种子培养

将步骤（1）活化得到的海洋青霉菌接种于装液量为40%的马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基（PDB）中，在25 ℃、150 rpm的条件下培养1 d，得到种子液；

（3）发酵培养

取种子液按体积分数5%的接种量接种于装液量为40%的发酵培养基中，于25 ℃，150 rpm的条件下培养12d，得到发酵液；

（4）发酵液体处理

将步骤（3）得到的发酵液过滤取上清液，乙酸乙酯萃取3次，去除有机相后用甲醇复溶，得到进样液；

（5）Flufuran的制备

采用高速逆流色谱（HSCCC）法对进样液进行分离纯化，得到海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体。

步骤（5）具体为： 

A.取正丁醇、醋酸和纯水按4：9：0.1的比例混合后作为HSCCC的两相体系；

B.将两相体系中以正丁醇为主的上相作为流动相，以醋酸和纯水为主的下相作为固定相，将流动相按10 mL/min的速度泵入高速逆流色谱仪直至高速逆流色谱仪转速达到900转/min后，将固定相按5 mL/min的速度泵入高速逆流色谱仪直至流动相和固定相达到平衡后进样；

C.启动检测器开始监测，收集含Flufuran的出峰时间为70min到90min部分的洗脱液，减压浓缩后得到纯度达90%的海洋青霉菌次级代谢产物Flufuran单体。

所述的发酵培养基的配制如下：将马铃薯浸出液10 g，可溶性淀粉20 g，溶于1 L海水中即可，其中海水由1 L纯水加入35 g海水晶配制而成。 

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，该发酵方法使Flufuran的产量大幅度提高，并缩短了发酵时间。此外，HSCCC制备该化合物具有进样量大、流速快的特点，尤其能够避免利用HPLC制备时酸性物质峰拖尾现象造成的样品浪费现象。该海洋青霉菌产Flufuran的量可达到1.91g/L。