[发明专利]一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法

权利要求书

1.一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶；

(2)以步骤(1)制备得到的磷脂酶D的固定化酶为催化剂，以醋酸丁酯为有机相溶剂，以pH5.5、50mM的醋酸钠缓冲液为水相溶剂，在温度20～60℃、CaCl₂存在条件下，L-丝氨酸与大豆磷脂按摩尔比10～100:1反应制备磷脂酰丝氨酸，反应结束后过滤回收磷脂酶D重复使用。

2.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶的方法包括如下步骤：

(1a)游离磷脂酶D的制备：Streptomyces racemochromogenes ATCC23954甘油菌经种子培养和发酵培养后得到含有磷脂酶D的发酵液，发酵液过滤除去菌体，收集清液，再经超滤处理得游离磷脂酶D酶液；

(1b)甲壳素的交联：以甲壳素为载体，加入交联试剂戊二醛溶液，室温下浸泡并搅拌1-5h，静置过夜，离心去除上清液，离心后的载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素载体；

(1c)游离磷脂酶D的固定化：在交联甲壳素载体中，加入游离磷脂酶D酶液和醋酸钠缓冲溶液，30℃下搅拌或者震荡吸附2～6h，取出过滤，并用醋酸钠缓冲液冲洗，置于4℃下保存。

3.根据权利要求2所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(1a)中，所述的超滤，其超滤膜的截留分子量为10kDa。

4.根据权利要求2所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(1b)中，所述的戊二醛溶液为用50mM、pH5.5的醋酸钠缓冲稀释的戊二醛，戊二醛溶液中溶质戊二醛的体积百分含量为1～5％；每1g甲壳素加入戊二醛溶液的体积为5ml。

5.根据权利要求2所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(1c)中，交联甲壳素载体与游离磷脂酶D的比为1g：10～50U。

6.根据权利要求2所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(1c)中，所述的醋酸钠缓冲溶液为50mM，pH5.5的醋酸钠缓冲溶液，游离磷脂酶D酶液和醋酸钠缓冲溶液的体积比为1：1。

7.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，磷脂酶D的固定化酶的用量为0.2～0.6U/ml反应体系。

8.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，CaCl₂的加入量为5mmol/L反应体系。

9.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，大豆磷脂与醋酸丁酯的用量比为40umol：2～10ml；L-丝氨酸与醋酸钠缓冲液的用量比为2mmol:2～10ml。

10.根据权利要求1所述的固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应时间为2～8h。