[发明专利]一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法。

背景技术

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)是一种重要的磷脂物质，具有突出的脑保健功能。虽然天然存在的PS分布广泛，但含量都非常低。目前，PS的制备主要为提取法与酶转化法，提取法主要从动物大脑组织中提取PS，近年来，由于疯牛病的原因，提取法制备的PS面临着食品安全性的问题。与此相比，酶转化法利用磷脂酶D催化卵磷脂的转酯反应制备PS，反应条件温和、过程简单、绿色环保，是制备PS的理想方法。

酶法制备PS以卵磷脂为原料，L-丝氨酸为醇供体，在磷脂酶D(phospholipase D,PLD)的作用下发生转磷脂酰反应生成PS，同时也会伴随卵磷脂的水解反应，如图1所示。

PLD是一种磷脂水解酶(EC3.1.4.4)，能够催化磷脂的水解，释放磷脂酸(PA)和醇残基。除了水解活性，PLD还能够催化转磷脂酰反应。磷脂酶D催化的磷脂酞转移反应是一个油-水两相之间的界面反应，磷脂酶D溶解在水相中，通过搅拌与油相中的反应底物在两相界面之间接触促使反应发生。酶在两相界面之间分布的越多，越能够提高反应速率，但磷脂酶D是水溶性的酶，与有机溶剂接触容易聚集结块，甚至失活，造成反应速率的下降。因此，能够促使磷脂酶D向有机相靠拢而又不会造成酶活力损失的方法能够提高转磷脂酰反应速率。目前，酶的固定化技术是用来解决这一问题的方法之一。将酶与合适的载体结合，可以增大与底物接触的面积，并且在酶周围形成一个具有保护作用的微环境，提高酶的有机溶剂耐受性和热力学稳定性。同时，磷脂酶D本身比较昂贵，将其固定化后容易从产物中分离回收，可重复利用，降低成本。

酶固定化方法根据载体，操作方法的不同，以及固定化的机理，主要可分为吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法和微囊法等。吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，操作简单，条件温和，对酶活保持较好，但是由于物理吸附作用力较弱，固定的酶易流失；交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，虽然固定的酶很牢固但是由于交联条件苛刻，酶分子易失活。现在越来越多的固定方法并不局限于单一方法的使用，而是根据需要来复合使用两种及两种以上的固定法以达到制备有两固定化材料的目的。

甲壳素(chitin)又称甲壳质、几丁质、壳多糖，是N-乙酰氨基葡萄糖单位通过β-1,4-糖苷键连接而成的直链多糖，为白色片状固体，无毒，无味，耐酸碱，耐腐蚀，耐高温，耐日光，性能十分稳定，是迄今为止发现的唯一天然碱性多糖。它大量存在于低等动物特别是节肢动物的甲壳中，是自然界中储备量仅次于纤维素的第二大天然可再生资源。甲壳素所具有的氨基被戊二醛活化后，可作为固定化磷脂酶D的载体。同时由于戊二醛对物质有很强的穿透力，利用它对甲壳素进行处理后，甲壳素的表面形成有机多孔结构，有利于酶的吸附。而且戊二醛为活泼的双功能试剂，它不仅与酶蛋白的氨基、羧基反应，还能活化甲壳素所具有的氨基。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种固定化磷脂酶D催化制备磷脂酰丝氨酸的方法，该方法包括如下步骤：

(1)以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶；

(2)以步骤(1)制备得到的磷脂酶D的固定化酶为催化剂，以醋酸丁酯为有机相溶剂(用于溶解大豆磷脂)，以pH5.5、50mM的醋酸钠缓冲液为水相溶剂(用于溶解L-丝氨酸)，在温度20～60℃、CaCl₂存在条件下，L-丝氨酸与大豆磷脂按摩尔比10～100:1反应制备磷脂酰丝氨酸，反应结束后过滤回收磷脂酶D重复使用。

步骤(1)中，以甲壳素为载体，以戊二醛为交联试剂，固定游离磷脂酶D得到磷脂酶D的固定化酶的方法包括如下步骤：

(1a)游离磷脂酶D的制备：Streptomyces racemochromogenes ATCC23954甘油菌经种子培养和发酵培养后得到含有磷脂酶D的发酵液，发酵液过滤除去菌体，收集清液，再经超滤处理得游离磷脂酶D酶液；

(1b)甲壳素的交联：以甲壳素为载体，加入交联试剂戊二醛溶液，室温下浸泡并搅拌1-5h，静置过夜，离心去除上清液，离心后的载体用蒸馏水反复冲洗以除去残余的戊二醛，抽滤，即得交联甲壳素载体；