[发明专利]限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法

权利要求书

1.一种基于限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)无标记的探针DNA和目标DNA的选取：所述无标记的探针DNA和目标DNA部分互补，并且都包含一段能被限制性内切酶识别并切割的5'-CCGG-3'特定序列，并且3'尾部分别都多出6个碱基序列；

(2)无标记的探针DNA与目标DNA的杂交；

(3)甲基化转移酶对双链DNA上CpG位点进行甲基化；

(4)对甲基化敏感的限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶ⅢExoⅢ同时作用DNA；

(5)加入荧光信号分子；

(6)利用荧光分光度计对产物溶液进行检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光信号分子为噻唑橙。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法的具体步骤如下：取无标记的探针DNA和目标DNA以及缓冲溶液于离心管中杂交，然后加入甲基转移酶使其CpG位点上的胞嘧啶甲基化，37℃反应1小时后，加入限制性内切酶HpaⅡ和核酸外切酶ⅢExoⅢ，37℃反应2.5小时，最后加入噻唑橙，室温条件反应1小时后，对其溶液进行荧光检测。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述无标记的探针DNA和目标DNA浓度在缓冲液中的终浓度分别为10～100nM。

5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述缓冲溶液为含有NaCl、MgCl₂、BSA和DTT的pH7～8的10～80mM的Tris-HCl，所述NaCl初始浓度为100～500mM，MgCl₂初始浓度为2～10mM，BSA初始浓度为为0.05～5mg/mL，DTT初始浓度为0.05～10mM。

6.根据权利要求1或3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述甲基转移酶在缓冲液中的终浓度为1～16U/mL。

7.根据权利要求1或3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶HpaⅡ在缓冲液中的终浓度为0～60U/mL。

8.根据权利要求1或3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述核酸外切酶Ⅲ在缓冲液中的终浓度为0～200U/mL。

9.根据权利要求1或3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述噻唑橙在缓冲液中的终浓度为0.7～3.0μM。