[发明专利]限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，本发明属于一种识别特殊甲基化位点和定量分析DNA甲基转移酶活性的生物传感技术，具体是指DNA甲基化后，被甲基化敏感的限制性内切酶识别并切割特定的序列后，核酸外切酶Ⅲ消化DNA，观测荧光信号分子噻唑橙信号的改变。 

背景技术

DNA甲基化是一种重要的修饰途径，在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，这常见于基因的5'-CG-3'序列(被称为CpG岛)。大量研究表明，DNA甲基化涉及到调控许多细胞过程，比如胚胎发育、转录、染色质结构、X染色体失活、基因组印迹和染色体的稳定性。 

在高等真核生物的正常细胞中，一般情况下CpG岛是未甲基化，但是，异常甲基化会抑制遗传信息的表达，会导致人类各种疾病比如癌症。因此，DNA甲基化可以作为疾病的一种潜在生物标志。然而，要了解DNA甲基化CpG机制，我们需要一个可以识别甲基化的DNA特定序列的系统，继而可以应用于疾病早期诊断和确定肿瘤的类型。然后，新的药物可以被研发并用于治疗与甲基化相关的疾病。 

传统的测序技术不能用于特殊位点的甲基化检测，因为甲基胞嘧啶和胞嘧啶仍能遵守沃森-克里克碱基对行为。目前，甲基化检测方法主要基于区别DNA上甲基胞嘧啶和胞嘧啶。例如，重亚硫酸盐处理方法、甲基化抗体识别方法和对甲基化敏感的限制性内切酶方法。基于重亚硫酸盐处理的方法中，亚硫酸氢盐能使DNA上的胞嘧啶脱氨转变成尿嘧啶，而5'甲基胞嘧啶没有变化，在通过PCR(polymerase chain reaction)扩增出所需片段后进行直接检测。利用甲基化抗体的方法来检测甲基化，甲基化抗体贵，成本高。在甲基化敏感限制性内切酶的方法中，该酶特异性识别甲基化的位置和选择性切断特定的DNA序列。如果在特定序列上的胞嘧啶被甲基化以后，那这段特定的序列就不会被限制性内切酶识别并切断。它提供了一个经济的方法来识别DNA甲基化的特定位点 和确定其甲基化程度。但是，这些方法中都没有提出同时确认甲基化特定位点和检测甲基转移酶活性。因为甲基转移酶在细胞分化和发育、基因的抑制、肿瘤和基因疾病中发挥了关键作用，所以甲基转移酶的活性评价在药物发现和临床诊断的领域是很重要的。因此，发展一种快速、简单、高效、选择性高来检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的方法是迫切需要的。 

发明内容

发明目的：针对现有技术的问题，本发明中针对基因中CpG位点进行分析的DNA甲基化检测和测定甲基转移酶活性方法，它具有快速、简便、无标记、经济、准确地确定DNA甲基化位点和检测甲基转移酶活性。 

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于限制性内切酶和核酸外切酶Ⅲ无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法，包括以下步骤： 

(1)无标记的探针DNA和目标DNA的选取：所述无标记的探针DNA和目标DNA部分互补，并且都包含一段能被限制性内切酶识别并切割的5'-CCGG-3'特定序列，并且3'尾部分别都多出6个碱基序列；其中，目标DNA是抑癌基因p53中的一段DNA序列； 

(2)无标记的探针DNA与目标DNA的杂交； 

(3)甲基化转移酶对双链DNA上CpG位点进行甲基化； 

(4)对甲基化敏感的限制性内切酶(HpaⅡ)和核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)同时作用DNA； 

(5)加入荧光信号分子； 

(6)利用荧光分光度计对产物溶液进行检测。 

其中，上述荧光信号分子为噻唑橙。其中，上述噻唑橙在缓冲液中的终浓度为0.7～3.0μM。噻唑橙染料与双链DNA结合时表现出荧光增强的特性。噻唑橙染料的水溶液几乎没有荧光，与单链DNA结合时会稍有荧光增强，当与双链DNA结合时，荧光有明显地增强。有报道表明：这是由于染料通过正负电荷静电吸引力与核酸结合时，喹啉环嵌入双链DNA分子的小沟中，染料分子由于受到空间位阻影响，其结构更趋于平面性，因而有荧光明显增强的现象图2。 

其中，上述检测方法的具体步骤如下：取无标记的探针DNA和目标DNA以及缓冲溶液于离心管中杂交，然后加入甲基转移酶使其CpG位点上的胞嘧啶甲基化，37℃反应1 小时后，加入限制性内切酶(HpaⅡ)和核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)，37℃反应2.5小时，最后加入噻唑橙，室温条件反应1小时后，对其溶液进行荧光检测。