[发明专利]一种制备异种脱细胞基质的方法及其产品

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程领域，具体涉及一种备异种脱细胞基质的方法。

背景技术

脱细胞真皮基质制备的目的是尽可能的去除皮肤组织中免疫原性很强的细胞成分（表皮细胞﹑毛囊﹑皮脂腺﹑汗腺及真皮中血管内皮细胞﹑成纤维细胞等），保留免疫原性相对较弱的细胞基质外成分以及真皮组织完整的三维空间结构。这样既能避免移植后的排斥反应和过强的免疫炎症反应，从而影响移植效果，又能提供引导组织再生的生物“模板”或支架，达到最大限度地修复组织缺损的目的。

目前脱细胞真皮基质的制备方法主要有以下几种：1) DispaseII- Triton 法: 皮肤标本先经DispaseII处理( 2.5 U/ ml溶液, 4e下作用48 h),再经TritonX-100 处理(0.5%溶液,室温下作用48 h)。DispaseII 主要分解IV 型胶原和纤维粘蛋白, 能裂解基底膜中的致密层，是一种快速有效的分离表皮与真皮的酶。标本经DispaseII处理后, 表皮真皮间的基底膜及皮肤附属器于周围结缔组织成分均被破坏。同时也破坏了纤维细胞和结缔组织基质间的连结, 更有利于TritonX-100 的浸透。TritonX-100 属于非离子型表面活性剂，在溶液中稳定性高,不易受强电解质无机盐存在的影响, 能与生物膜中的磷脂等脂质结合形成复合物, 溶解于溶液中。同时, TritonX-100中的疏水端也能和膜蛋白破坏生物膜，从而使细胞溶解破坏。

2)高渗盐-SDS法:皮肤标本先经高渗盐作用(1mol/LNaCl溶液,37e下作用24h)使锚着细丝与表皮基底细胞的半桥粒分离开米,从而完整地去除表皮。然后在未改变胶原结构的情况下, 再用破膜剂十二烷基硫酸钠(0.5%SDS溶液,室温下作用1h)将皮肤标本中的细胞脱除。该法细胞脱除也比较彻底,基底膜完整保留, 但真皮中Ⅳ胶原,纤维结合素,弹力素,HLA-DR 等含量较多,因此具有相对高的抗原性。

3)高渗盐-NaOH消蚀法,该法利用高渗盐(1mol/LNaCl溶液, 37e下作用24h)去除表皮,同时再利用NaOH(低浓度溶液,室温下作用18h)中碱离子的吸水作用, 夺取组织细胞的水分,使细胞脱水而死亡。最后使用超声清洗仪清洗除去细胞。该法细胞彻底脱除, 胶原纤维结构完整, 排列较正常松散。但要注意控制NaOH 的作用时间,过长(如36h) 则会使胶原变性,蛋白裂解,得到的是真皮皮浆。

4)其它:Lee Y等用胰蛋白酶(0.25%溶,4e下作用24h),接着TritonX-100( 0.1%溶液,室温下作用8h) ,最后用Dispase (560 units/L,4e下作用24h)。Ray等使用胰蛋白酶( 0.25%溶液,室温下作用18h)和SDS(0.1%溶液,室温下作用12h),然后用胰蛋白酶再作用12h,最后用Dispase (560 units/L, 25e下作用12h)。

其它辅助制备措施：

1)戊二醛交联:一般用2ml/L的戊二醛溶液交联皮肤标本510min。该措施是利用醛基封闭抗原位点作用, 降低异种/异体ADM 的免疫炎症反应,减缓组织降解。更有利于ADM 的创面黏附和移植成活。但同时醛基又有细胞毒性作用,导致滞后的炎症细胞浸润和异物巨细胞反映。对于戊二醛醛基矛盾性的作用,有待进一步的深入研究。

2) 网状打孔:选择孔径500-800um,间距为35mm。孔径的选择十分重要,经大量的理论和实验证明,孔径过大或过密,会增加抗原位点的暴露和抗原提呈细胞等接触ADM 的机会。该措施是利用毛细现象, 使创面基底血浆等渗液渗透到无细胞真皮替代物表面, 维持皮片早期的营养供应, 并防止皮下积液、积气及血肿形成。

检索近年来有关脱细胞真皮基质制备的相关文章，考虑到脱细胞效果以及对细胞外基质的损伤程度，脱细胞真皮基质的制备顺序一般是制备断层皮片，然后预处理，再经过脱细胞处理后，进行交联处理，最终病毒灭活。此种制备技术存在以下不足：1.细胞真皮制备过程中酶消化或高渗盐处理过度将破坏胶原三维结构,反之则可能残留细胞成分,引起排斥反应;2.缺乏血管网结构, 导致其缺血时间,再灌注时间和无营养支持的时间较长;3.脱细胞基质制备中孔隙率和通孔率不理想，使成纤维细胞不易于黏附迁移；4.常用交联剂戊二醛交联后易发生钙化，变硬﹑变脆现象。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种步骤简单、成本低廉、效果好的制备异种脱细胞基质的方法。本发明同时提供了上述方法制备的异种脱细胞基质。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：