[发明专利]海豚链球菌快速检测引物及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海豚链球菌快速检测引物及其方法，属于观赏鱼病原菌快速检测领域。

背景技术

海豚链球菌隶属于芽孢杆菌纲(Bacilli)、乳杆菌目(Lactobacillales)、链球菌科(Streptococcaceae)、链球菌属(Streptococcus)，为一种具溶血性的革兰氏阳性球菌，是养殖鱼类的重要致病菌之一，可以引起罗非鱼、澳洲肺鱼、虹鳟、斑点叉尾鮰、杂交条纹鲈鱼、牙鲆及河豚等的感染，造成很高的死亡率。近年来海豚链球菌在养殖的观赏鱼中多次被发现，引起被感染的图丽鱼、罗汉鱼眼睛突起、鳃盖出血、腹水等症状，具有很强的传染性，死亡率在30％以上。观赏鱼的价值在于其观赏性，一旦发生海豚链球菌的感染，即便及时治疗挽回部分鱼的生命，其观赏价值也大受影响，由此造成的经济损失巨大。因此对于观赏鱼海豚链球菌病，病原早期的检测与及时采取有效的预防治疗措施尤为重要。目前对于海豚链球菌的检测，主要通过细菌分离、生化鉴定、血清学反应及PCR技术来进行，耗时长，成本高，多以杀死水产动物为前提，操作复杂，需要专业的仪器设备和技术人员，不适用于实际生产中病原的实时监测。养殖生产中亟需一种能够应用于养殖现场的、对鱼体损伤小的、快速准确、操作简便的海豚链球菌检测技术。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)是2000年建立的一种新型核酸扩增技术，其特征是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物，在一种链置换DNA聚合酶的作用下，保持等温条件(60～65℃)30～60min即可完成核酸扩增反应，加入核酸染料SYBR Green I或钙黄绿素，有核酸扩增即可显示颜色反应，即时得到检测结果。目前尚未有关于海豚链球菌LAMP检测技术的报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种海豚链球菌快速检测引物。

本发明的第二个目的是提供一种对鱼体损伤小的、快速准确、操作简便的海豚链球菌快速检测方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种海豚链球菌快速检测引物，其特征是由外引物和内引物组成，所述外引物由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物和SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物组成；所述内引物由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。

一种海豚链球菌快速检测方法，其特征是包括如下步骤：

(1)提取待检样品DNA；

(2)在装有19μl LAMP反应基础液的200μl PCR反应管中加入4μl引物混合液，1μl Bst DNA聚合酶，1μl待检样品DNA模板，配成25μl的LAMP反应体系；于60-65℃放置40-60min，再于85℃放置15min得到检测液；

(3)采用质量浓度1％的琼脂糖电泳检测检测液是否产生连续的阶梯状的DNA条带，是则为阳性，或在检测液中加入1μl荧光染料SYBR Green I工作液，肉眼观察颜色反应，呈绿色为阳性，呈橙红色为阴性，阳性表示待检样品中含有海豚链球菌；阴性表示不含有海豚链球菌；

所述引物混合液是等体积的浓度为5μmol/L由SEQ ID NO.1所示的外引物上游引物，浓度为5μmol/L由SEQ ID NO.2所示的外引物下游引物，浓度为40μmol/L由SEQ ID NO.3所示的内引物上游引物和浓度为40μmol/L由SEQ ID NO.4所示的内引物下游引物组成。

待检样品优选为鱼血液、鱼脾、鱼肾组织或细菌。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)本发明解决了现有技术检测海豚链球菌周期长、检测成本高、不能应用于现场检测等问题，本发明在2h内即可完成所有检测操作，简单快速。

(2)本发明基于检测海豚链球菌共有的溶血基因co-hemolysin gene，可用于养殖生产中海豚链球菌的检测，准确性高，灵敏度较常规的PCR高2-3个数量级，实验室检测所能检测海豚链球菌的最低浓度为3×10²cfu/ml。

(3)检测成本低，无需PCR仪之类的专业仪器设备，只需一台控温精准的水浴锅，操作简便，适合现场检测。

(4)不需经过细菌培养，检测所需样品量少，仅需取少量鱼类血液或组织即可进行检测，实现了微创取样，尤其适用于经济价值较高的观赏性鱼类。

(5)本发明还可以用于水体中海豚链球菌的检测。

附图说明