[发明专利]一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法

权利要求书

1.一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)从叶越桔植株上获取当年生的樟叶越桔茎段作为外植体，外植体剪除叶片剪成4～6cm长的茎段，用洗洁精水浸泡30～60min，流水冲洗1～2h后再用酒精和升汞消毒，消毒后用无菌水冲洗，无菌条件下切成带1～2个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基上进行培养，叶腋处诱导出腋芽后继续培养；所述的腋芽诱导培养基为：WMP+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.5～1.5mg/L+活性炭2.0～3.0g/L，pH5.4～5.8；

(2)腋芽的增殖诱导：待腋芽长成3cm以上的小苗后，将其切成1.5～2cm长带1～3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行培养；培养至小苗长至3～4cm高且叶腋处可诱导出新的不定芽小苗即得到樟叶越桔组培苗；所述的腋芽增殖培养基为：WMP+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.2～1.0mg/L+活性炭1.0～2.0g/L，pH5.4～5.8；

(3)樟叶越桔组培苗的生根诱导：将樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中培养诱导生根得到樟叶越桔生根苗；所述的生根培养基为：WMP+6-BA0.5～1.5mg/L+NAA0.1～1.0mg/L+活性炭0.1～1.0g/L，pH5.4～5.8。

2.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述的消毒为：用75％酒精浸泡15～30s，再用0.1％升汞浸泡7～12min。

3.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于：腋芽诱导培养基、腋芽增殖培养基和生根培养基中的凝胶剂是琼脂或卡拉胶，培养基中的蔗糖为食用白糖，培养基中的水为自来水，培养基pH值用1mol/LNaOH或HCl来调节。

4.根据权利要求3所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于：凝胶剂的终浓度为4～5g/L，蔗糖的终浓度为20～30g/L。

5.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于：步骤(1)中所述的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比14～15h:9～10h。

6.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于：步骤(2)中所述的培养条件为：培养温度27±2℃，光照强度2100～2300lx，光照周期比12h:12h。

7.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于：步骤(3)中所述的培养条件为：培养温度28±2℃，光照强度1700～1800lx，光照周期比10h:14h。

8.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于：还包括咖啡酰熊果苷含量的测定。

9.根据权利要求8所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于：咖啡酰熊果苷含量的测定方法包括如下步骤：

(1)将样品在自然条件下风干、粉碎后称取0.5g置于10mL容量瓶中，加入60％甲醇10mL，称重，超声3次，每次30min，静置24h后用60％甲醇补足至前面所称重量，过微孔滤膜d＝0.45μm，得供试样品溶液；

(2)高效液相色谱测定咖啡酰熊果苷的含量，条件如下：色谱柱Agilent Analytical Eclipse XDB-C18(4.6mm×150mm，0.5μm)，流动相：甲醇/水体系(含冰醋酸1％)，洗脱体系：0～5min5％甲醇，5～10min5％～15％甲醇，10～50min15％～65％甲醇，50～55min65％～95％甲醇，流速：1.0mL/min，进样量40μL，检测波长280nm，柱温30℃；通过咖啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测定，对照品线性方程为y＝1152.3x+190.03，R²＝0.9998。