[发明专利]一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法。

背景技术

樟叶越桔(Vaccinium dunalianum)是杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物，常绿灌木。主产于云南、四川、贵州、西藏等地，我国台湾以及锡金、不丹、印度(东北部)、缅甸(东北部)至越南亦有分布，在云南省境内则主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东南。其幼嫩叶芽，因形似雀嘴呈锥状，在云南彝族民间又称“雀嘴茶”，据记载自明代开始就作为一种茶代用品长期饮用至今，具有祛风除湿、舒筋活络等功效。越桔属植物富含多种营养成分，并具有多方面的生理活性，同时也是广泛应用于化妆品行业的熊果苷(arbutin)原料的主要植物来源之一。熊果苷是源于绿色植物的天然活性物质，是当今流行的最为安全有效的美白原料，也是国际公认的二十一世纪的理想皮肤美白祛斑活性剂。由于熊果苷作为次生代谢产物通常以微量形式存在于植物体中，且天然植物来源困难，因此，筛选熊果苷高产天然植株或寻找熊果苷天然替代品已经成为当务之急。

申请人前期研究发现，樟叶越桔是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物，其中6’-O-咖啡酰熊果苷的得率高达植物材料干重的22％(Zhao P,Tanaka T,Hirabayashi K,et al,2008.Caffeoyl arbutin and related compounds from the buds of Vaccinium dunalianum.Phytochemistry,69(18):3087-3094.)，并对其制备方法进行了专利保护(赵平,张颖君,许敏,杨崇仁,2007.6’-O-咖啡酰基熊果甙的制备方法.授权专利号：ZL200710065956.X)。生物活性研究结果表明，该化合物的酪氨酸酶抑制活性和抗氧化等活性均优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2，可望作为熊果苷天然替代品加以应用，具有重要的开发价值。由于樟叶越桔处于野生状态，生长缓慢，分布有限，加之随着雀嘴茶的关注度不断提高，导致其连年遭受破坏性采摘，野生樟叶越桔数量急剧减少。现有技术目前尚无采用组织培养技术获得高含量咖啡酰熊果苷植物材料的报道，有必要采用现代生物技术手段解决当前樟叶越桔的资源匮乏问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，基于咖啡酰熊果苷在樟叶越桔植物体的分布特点及其所具有的药理活性，提供一种培养过程简单、高效且富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法。该方法具有繁殖速度快、周期短、咖啡酰熊果苷含量高等优点，是获取大量高含量咖啡酰熊果苷的樟叶越桔材料的有效途径。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)从叶越桔植株上获取当年生的樟叶越桔茎段作为外植体，外植体剪除叶片剪成4～6cm长的茎段，用洗洁精水浸泡30～60min，流水冲洗1～2h后再用酒精和升汞消毒，消毒后用无菌水冲洗，无菌条件下切成带1～2个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基上进行培养，叶腋处诱导出腋芽后继续培养；所述的腋芽诱导培养基为：WMP+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.5～1.5mg/L+活性炭2.0～3.0g/L，pH5.4～5.8。

(2)腋芽的增殖诱导：待腋芽长成3cm以上的小苗后，将其切成1.5～2cm长带1～3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行培养；培养至小苗长至3～4cm高且叶腋处可诱导出新的不定芽小苗即得到樟叶越桔组培苗；反复将3～4cm高的组培苗切成1.5～2cm长带1～3个叶腋的茎段在腋芽增殖培养基上进行增殖培养，可以使得樟叶越桔进行快速大量的扩繁；所述的腋芽增殖培养基为：WMP+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.2～1.0mg/L+活性炭1.0～2.0g/L，pH5.4～5.8。

(3)樟叶越桔组培苗的生根诱导：将樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中培养诱导生根得到樟叶越桔生根苗；所述的生根培养基为：WMP+6-BA0.5～1.5mg/L+NAA0.1～1.0mg/L+活性炭0.1～1.0g/L，pH5.4～5.8。

步骤(1)中所述的消毒优选为：用75％酒精浸泡15～30s，再用0.1％升汞浸泡7～12min。

步骤(1)中所述的培养条件优选为：培养温度25±2℃，光照强度2000～2500lx，光照周期比14～15h:9～10h。