[发明专利]一种基于Taq酶末端转移酶活性构建T载体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种载体构建的方法，具体为一种基于Taq DNA聚合酶末端转移酶活性构建T载体的方法。

背景技术

T载体是一种方便的克隆PCR产物的线性载体，T-A克隆技术被证明对PCR产物的克隆极具价值。此方法的原理是利用TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性的末端转移酶活性，可将PCR双链产物的每一条链的3′-端加入一个突出的dA碱基，而线性T载体的3′-端正好含有与之互补配对的突出dT碱基，从而实现T-A互补连接。

目前，经典的T载体构建方法有2种。第一种是先将质粒通过EcoR V或Sam I等切口平末端的限制性内切酶线性化，然后利用末端转移酶或者具有末端转移酶活性的Taq DNA聚合酶在dTTP或ddTTP环境中给质粒平末端3′-端添加T。第二种方法是利用限制性内切酶酶切的方法，即在T载体前体中引入2个串联的能产生3′-端突出单碱基末端的限制性内切酶如Xcm I或Ahd I等识别位点，使用这些酶切割特异性序列后产生的末端为3′-端突出单碱基N（N代表任意碱基），如果将该碱基设计为T，则可以通过酶切T载体前体使其产生2个3′-端突出T碱基而成为T载体。

目前T载体的构建方法多采用第一种方法，如Promega和TaKaRa公司的产品，以及国内几家公司的产品。但由于Taq DNA聚合酶末端转移酶活性主导下的3′-端加T反应是一个动态平衡的过程，并非所有的质粒3′-端均可添加上T，其加T效率一般35%~55%之间，因此以此方法构建的T载体往往存在大量3′-端未添加T的平端载体。在PCR产物T-A克隆过程中会出现载体自身环化背景高，PCR产物连接效率低，阳性克隆筛选困难等问题。因此，如何在TaqDNA聚合酶末端转移酶活性主导下的3′-端加T反应后，有效去除3′-端未添加T的质粒，以减少T-A克隆过程中载体自身环化背景，是制备高质量、稳定、高效T载体的前提，也是本发明重点解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于TaqDNA聚合酶的末端转移酶活性高效构建T载体的方法，利用该方法获得的T载体质量稳定，自身环化背景低，克隆效果好，不但适用于小规模制备，也适用于大规模生产，将在基因工程领域发挥重要作用。

实现本发明的目的包括下列步骤：

步骤1．利用平末端内切酶酶切出发载体，回收获得线性化平末端载体；

步骤2．利用TaqDNA Polymerase末端转移酶活性，在二价金属阳离子的作用下给线性化平末端载体加T，回收获得中间T载体；

步骤3．利用T4 DNA Ligase连接步骤2所得中间T载体，去除3′-端未加T载体，回收获得T载体。

其中，所述平末端内切酶为EcoR V、Sma I、Sca I中任何一种；所述出发载体为pBluescript SK(+)、pUC18、PGEM-7Zf(+)中任何一种；所述二价金属阳离子为MgCl₂、MnCl₂、CoCl₂、CdCl₂中任何一种。所述二价金属阳离子优选1 mM浓度的CdCl₂。

出发载体加入量与平末端内切酶酶量比例为:1 ug出发载体，加入10 U的平末端内切酶酶量。

本发明所构建T载体的方法是利用TaqDNA聚合酶末端转移酶活性在线性化平末端出发载体的3′-端添加T，然后利用T4 DNA连接酶去除3′-端未加T载体自身环化背景，获得3′-端具有单个T突出的线性T载体。

本发明有益效果：本发明所述构建T载体的方法简单高效，利用该方法所获得的T载体不仅具备出发载体的优点，还包含出发载体的不同多克隆位点，而且质量稳定、无自身环化背景、克隆效率高，可极大方便PCR产物的T-A克隆（具体结果见实施例3中图4、图5）。

附图说明

图1为本发明pBluescript SK(+)载体线性化检测结果图。其中：泳道1为pBluescript SK(+)载体，泳道2为线性化的平末端pBluescript SK(+)载体，泳道M为250 bp DNA marker（见实施例1）。

图2为本发明中间T载体3′-端加T比例检测结果图。图2中A表示蓝、白斑显色结果；图2中B表示琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中：泳道1-5为白斑菌落PCR扩增结果，泳道6-10为蓝斑菌落PCR扩增结果，泳道M为DL 2000 DNA marker（见实施例2）。