[发明专利]一种利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法

权利要求书

1.一种利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于包括如下步骤： 

(1)将重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVSC1/pYα-hBD-3菌种划线于YPD培养基平板中，培于28～30℃培养2～3d至长出单菌落；挑取单菌落划线接种于YPD培养基平板上，于28～30℃培养1～2d，再挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，28～30℃、180～250r/min培养过夜，得到种子液体； 

(2)取步骤(1)制备的种子液体接种于水蓼生长培养基中，28～30℃、180～250r/min振摇培养，培养24～36h至OD₆₀₀为1～4时停止生长培养，得到培养液； 

(3)取步骤(2)中得到的培养液低速离心，弃上清液，用无菌水清洗两遍，低速离心，弃上清液，得到重组酿酒酵母生长培养菌体； 

(4)将步骤(3)所得的重组酿酒酵母生长培养菌体转接至水蓼诱导培养基，28～30℃、180～250r/min振摇培养，培养48～72h，收集诱导培养液。 

2.根据权利要求1所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于，还包括如下步骤： 

(5)将步骤(4)收集的诱导培养液，低速离心，弃沉淀，收集上清液，BCA蛋白定量法测定上清液的蛋白含量； 

(6)于营养肉汤培养基中加入菌液，制成含菌平板，待平板凝固后，在其上放置牛津杯，并加入步骤(5)所得的上清液，37℃培养16～18h，观察抑菌圈的直径，以抑菌圈直径的大小表示抑菌效果。 

3.根据权利要求1所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于： 

步骤(2)所述的水蓼生长培养基通过如下步骤制备：50～90g/L葡萄糖，6.7g/L YNB，腺嘌呤、精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸各0.1g/L，天门冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸和缬氨酸各0.05g/L，20～40g/L蛋白胨，20～60g/L水蓼；121℃高压灭菌20min后备用。 

4.根据权利要求1所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于： 

步骤(4)所述的水蓼诱导培养基通过如下步骤制备：20～40g/L葡萄糖， 6.7g/L YNB，腺嘌呤、精氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸和色氨酸各0.1g/L，天门冬氨酸、组氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸和缬氨酸各0.05g/L，30～50g/L蔗糖，20～40g/L酵母浸膏，20～60g/L水蓼；121℃高压灭菌20min后备用。 

5.根据权利要求1所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于：步骤(2)所述的种子液体接种于水蓼生长培养基中，按体积比(1～3)：100的比例接种。 

6.根据权利要求1所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的重组酿酒酵母生长培养菌体转接至水蓼诱导培养基，为每100mL培养液收集得到的重组酿酒酵母生长培养菌体转接至100mL水蓼诱导培养基。 

7.根据权利要求1所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于：步骤(2)、(4)所述的水蓼指水蓼干粉，制法如下：采摘于6～7月份，40～80cm高的水蓼(Polygonum hydropiper)植物，洗净后低温真空冷冻干燥12～16h，用粉碎机磨成粉末后，过100目筛备用。 

8.根据权利要求2所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于：步骤(6)所述的菌液为大肠杆菌(Escherichia coli)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的菌液；所述的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的终浓度为10⁴～10⁵cfu/mL。

9.根据权利要求2所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法，其特征在于： 

步骤(6)所述的含菌平板的厚度为4～6mm； 

步骤(6)所述的牛津杯的直径为8mm。 

10.权利要求1～9任一项所述的利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法在提高酿酒酵母分泌表达人β防御素3中的应用。