[发明专利]一种利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物应用领域，具体涉及一种利用水蓼促进酿酒酵母分泌表达人β防御素3的方法。

背景技术

防御素是抗菌肽家庭中最大的亚家族，是生物体内产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽活性物质，是生物体先天免疫的重要组成部分，与干扰素、补体等组成了宿主的免疫防御系统。截止目前研究发现防御素的种类有：哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素；而根据二硫键的位置，连接上的差异以及前体和表达方式不同，防御素又分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3类。

人β防御素3(human D-defensin-3，hBD-3)是2001年Harder等在银屑病患者皮损组织中发现的防御素D家族抑菌活性最高的肽。hBD-3是由45个氨基酸组成的小分子多肽，相对分子质量为5154.7，由1个α螺旋和3个反向平行的β折叠片层组成，同时有一个短螺旋环在氨基末端区域形成。hBD-3由6个半胱氨酸残基形成3个二硫键，其连接方式为2～4、l～5、3～6。3个反向平行的β折叠片层通过17～19、27～31、39～43残基形成。

相较于其他β防御素而言，人β防御素3的功能性更广：(一)显著的抗细菌、抗真菌及抗病毒的活性，且抑菌浓度比已经观察到的防御素家族的其他成员更低；(二)在连接先天和获得性免疫应答中起到重要的桥梁作用；(三)诱导专职抗原递呈细胞产生和活化，有望成为疫苗佐剂；(四)其抗菌活性是非盐离子浓度敏感性的，不易引起溶血。在滥用抗菌药物、细菌耐药性问题日益严重的今天，人β防御素因具有高效杀菌、不易产生耐药性突变、无毒、适用性广、性能稳定等优点，有望代替传统的抗生素，开发成为新一代抗细菌、真菌、病毒和抗癌的药物，应用开发前景广阔。

但是，要将人β防御素3真正应用于生产实践，必须首先建立成本低廉、高效稳定的制备工艺，解决工业批量化生产问题。目前，防御素主要通过以下3种途径获得：(1)诱导生物体分泌表达后分离纯化；(2)化学合成；(3)构建防御素基因工程菌株。但天然存在的防御素产量很低，无法从动植物体内大量提取，且分离纯化具有抗菌活性的组分无疑是一件非常繁琐的工作；而化学合成防御素也存在成本高，大批量生产困难的弱点，因此，前2种方法无法满足防御素工业化生产的需求。相较而言，以工程菌工业化发酵生产防御素，可大规模生产，其生产周期短、生产成本低且不受季节和气候变化等外在环境影响，因而探索适当的防御素诱导途径成为该领域研究的焦点。有许多实验对不同来源的防御素进行了重组表达尝试，涉及的表达系统包括大肠杆菌系统、酵母系统等。

黄蓬亮(黄蓬亮，赵亚华，许少鹏.人β-防御素3在大肠杆菌中可溶性表达及其生物活性的鉴定.生命科学研究，2005，9(2)：129-133)等根据大肠杆菌对精氨酸密码子使用偏好合成了人β-防御素3，在大肠杆菌中诱导表达成功。大肠杆菌表达体系虽具有一定简易性和大众性，但仍有一些缺陷：1)缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰和加工过程，二硫键无法正确形成，影响了蛋白的正确折叠，表达后的抗菌肽活性受到影响；2)表达的蛋白质多以包含体形式存在，防御素的纯化和回收，不仅增加成本，而且影响防御素的生物活性；3)杂蛋白多，纯化步骤复杂等。

唐语谦等(吴晖，陈艺，肖俊梅，唐语谦.人β防御素3基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达.现代食品科技，2012,28(9)：1123-1127)已将人β防御素3的基因插入pYα载体中，并在酿酒酵母INVSC1中成功表达，重组酿酒酵母INVSC1/pYα-hBD-3分泌表达的重组人β防御素3显示出良好的抑菌活性。

水蓼，又名辣蓼草，为蓼科蓼属植物水蓼的全草(赵春光.野生小草防治龟鳖鱼疾之辣蓼草.南方农村报,2003,4-6)。蓼科植物主要分布在北温带，蓼属是其中一个药用大属，分布于全国各地。水蓼味辛酸、性温，具有导滞化湿，祛风止痒，化瘀止血，解毒之功效，一定程度上可抑制细菌的生长。水蓼中含有丰富的酵母菌及根霉菌所需的生长素，风干后的水蓼干草粉含无氮浸出物41.7％，粗蛋白15.5％，粗脂肪2.6％，钙质4.03％，磷0.52％，还含有挥发油、鞣质、黄酮、黄酮衍生物、蓼素、水蓼素、水蓼素-7-甲醚、鼠李欣素及金丝桃甙等有效成分(李家寿,陈靖显.黄酒酿造工艺.中国酿酒工业协会黄酒分会,2004,59-62)。由此可知，水蓼有促进酵母菌等繁殖的作用(高永强,徐大新.辣蓼草对机械化黄酒酵母菌的影响研究.酿酒,2009,36(6):67-68.)。而酿酒酵母作为真菌表达系统，表达蛋白量较低，限制了其应用。

发明内容