[发明专利]一组抗肿瘤T淋巴细胞群及其制备方法

权利要求书

1.一组抗肿瘤T淋巴细胞群，其特征在于，其包括表达人白细胞分化抗原CD3的细胞占71.63％～86.32％，表达人白细胞分化抗原CD4的细胞占16.43％～27.37％，表达人白细胞分化抗原CD8的细胞占65.58％～76.86％，表达人αβT细胞受体的细胞占11.90％～17.51％，表达人γδT细胞受体的细胞占69.95％～83.74％。

2.根据权利要求1所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：取去白细胞滤器，过滤全血后，白细胞残留在滤器中；

步骤二：使用磷酸缓冲液冲洗去白细胞滤器，获得PBS、白细胞和部分血液的混合液；

步骤三：将磷酸缓冲液、白细胞和部分血液的混合液离心弃去血浆；

步骤四：向弃去血浆的细胞混合液中加入磷酸缓冲液，小心混匀形成混合液；

步骤五：将混合液小心叠加于细胞分离液上离心，此时离心管中由上向下分为四层：第一层为血浆层；第二层为环状乳白色单个核细胞层；第三层为透明分离液层；第四层为红细胞层；收集第二层细胞放入含磷酸缓冲液的试管中，充分混匀后，离心，弃去上清留沉淀,然后重复洗涤,最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞；

步骤六：将所分离的外周血单个核细胞培养于37℃，5％CO₂培养箱，用抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基过夜培养后，收集悬浮的淋巴细胞；

步骤七：每2-3天在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在5×10⁵～10×10⁵个细胞/mL，每次传代培养的条件均为37℃，5％CO₂，传5代以上，每代的培养条件相同，得到抗肿瘤T淋巴细胞群；

其中，所述抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基为是在无血清淋巴细胞培养基中添加异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2得到的培养基。

3.根据权利要求2所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液为含有135mM NaCl、4.7mM KCl、10mMNa₂HPO₄、2mM NaH₂PO₄且pH值为7.4的水溶液。

4.根据权利要求3所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤一中去白细胞滤器的规格为2单位400ml，全血为400ml，所述步骤二中的磷酸缓冲液为40-80ml。

5.根据权利要求4所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的离心速率为1500-2500转/分，离心时间为15-20分钟。

6.根据权利要求5所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤四中加入的磷酸缓冲液为25-40ml。

7.根据权利要求6所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤五中的细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司，产品编号为LTS1077，细胞液和细胞分离液的体积比为1.5:1-2:1，混合后离心的速率为2000-2500转/分，离心时间为15-20分钟。

8.根据权利要求7所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述步骤五中收集第二层细胞是放入含20-45ml的磷酸缓冲液的试管中，与磷酸缓冲液混匀离心速率为2000-2500转/分，离心时间为10-15分钟，然后以同样转速和时间重复洗涤两次。

9.根据权利要求8所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基的pH为7.2-7.4，用量为30毫升，其中，异戊烯焦磷酸在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是200μg/L，人白细胞介素-2在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中的浓度是100万U/L。

10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，它以权利要求1所述的一组抗肿瘤T淋巴细胞群为活性成分。