[发明专利]一组抗肿瘤T淋巴细胞群及其制备方法在审

专利信息
申请号: 201410232783.6 申请日: 2014-05-29
公开(公告)号: CN103981146A 公开(公告)日: 2014-08-13
发明(设计)人: 蒋宇扬;陈妍 申请(专利权)人: 深圳市坤健创新药物研究院;清华大学深圳研究生院
主分类号: C12N5/0783 分类号: C12N5/0783;A61K35/14;A61P35/00
代理公司: 深圳市中知专利商标代理有限公司 44101 代理人: 孙皓;陈贞
地址: 518000 广东省深圳市*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一组 肿瘤 淋巴细胞 及其 制备 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及一组抗肿瘤T淋巴细胞群及其制备方法。

背景技术

近年来肿瘤的免疫治疗越来越受到重视。目前肿瘤的免疫疗法主要包括肿瘤疫苗、单克隆抗体技术、细胞因子治疗、过继性细胞免疫治疗等。其中过继性细胞免疫治疗是指向肿瘤患者传输具有抗肿瘤活性的免疫细胞,直接杀伤肿瘤或激发机体抗肿瘤免疫效应,从而达到治疗肿瘤的目的。主要的过继性细胞包括淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(anti-CD3MeAbactivatedkiller cells)等。值得注意的是γδT细胞在过继免疫治疗中的潜在作用。γδT细胞是介于获得性免疫与天然免疫之间的特殊免疫细胞类型,具有抗原特异性识别功能而无MHC限制,可在IL-2刺激下扩增,并在体外呈现出杀伤多种肿瘤的功能。以γδT细胞为基础的免疫治疗在肺癌、肾癌、恶性黑色素瘤等Ⅰ期临床研究中已显示出良好效果,尤其是转移性恶性黑色素瘤,提示其可能成为治疗肿瘤的新途径。CD8+T细胞(TC或CTL细胞)能杀伤表达抗原的靶细胞,它在抗病毒感染、急性同种异型移植物排斥以及杀伤肿瘤细胞作用中是重要的效应细胞。在正常机体中CD8+T细胞以不活化的静息T细胞的形式存在。它必须经过抗原激活并在T辅助(TH)细胞协同作用下,才能分化发育为效应杀伤T细胞(TC)。临床病例报告CD8+T对不同类型的肿瘤具有不同的作用。目前,尚无报导具有抗肿瘤作用的混合的淋巴细胞群。

发明内容

本发明提供了抑制乳腺癌和肝癌细胞株的增殖、诱导癌细胞凋亡且抑制肝癌乳腺癌荷瘤小鼠体内肿瘤的生长的一组抗肿瘤T淋巴细胞群,本发明还提供了所述一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法。

本发明提供了一组抗肿瘤T淋巴细胞群,其包括表达人白细胞分化抗原CD3的细胞占71.63%~86.32%,表达人白细胞分化抗原CD4的细胞占16.43%~27.37%,表达人白细胞分化抗原CD8的细胞占65.58%~76.86%,表达人αβT细胞受体的细胞占11.90%~17.51%,表达人γδT细胞受体的细胞69.95%~83.74%。

本发明还提供了上述一组抗肿瘤T淋巴细胞群的制备方法,包括如下步骤:

步骤一:取去白细胞滤器,过滤全血后,白细胞残留在滤器中;

步骤二:使用磷酸缓冲液冲洗去白细胞滤器,获得PBS、白细胞和部分血液的混合液;

步骤三:将磷酸缓冲液、白细胞和部分血液的混合液离心弃去血浆;

步骤四:向弃去血浆的细胞混合液中加入磷酸缓冲液,小心混匀形成混合液;

步骤五:将混合液小心叠加于细胞分离液上离心,此时离心管中由上向下分为四层:第一层为血浆层;第二层为环状乳白色单个核细胞层;第三层为透明分离液层;第四层为红细胞层;收集第二层细胞放入含磷酸缓冲液的试管中,充分混匀后,离心,弃去上清留沉淀,然后重复洗涤,最后沉淀得到所分离的外周血单个核细胞;

步骤六:将所分离的外周血单个核细胞培养于37℃,5%CO2培养箱,用抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基过夜培养后,收集悬浮的淋巴细胞;

步骤七:每2-3天在该抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基中传代一次,使细胞浓度维持在5×105~10×105个细胞/mL,每次传代培养的条件均为37℃,5%CO2,传5代以上,每代的培养条件相同,得到抗肿瘤T淋巴细胞群;

其中,所述抗肿瘤T淋巴细胞群专用培养基为是在无血清淋巴细胞培养基中添加异戊烯焦磷酸和人白细胞介素-2得到的培养基。

所述磷酸缓冲液为含有135mM NaCl、4.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM NaH2PO4且pH值为7.4的水溶液。

所述步骤一中去白细胞滤器的规格为2单位400ml,全血为400ml,所述步骤二中的磷酸缓冲液为40-80ml。

所述步骤三中的离心速率为1500-2500转/分,离心时间为15-20分钟。

所述步骤四中加入的磷酸缓冲液为25-40ml。

所述步骤五中的细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司,产品编号为LTS1077,细胞液和细胞分离液的体积比为1.5:1-2:1,混合后离心的速率为2000-2500转/分,离心时间为15-20分钟。

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