[发明专利]一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法

权利要求书

1.一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于步骤如下：

A、选择细胞系作为制苗用细胞；

B、制苗用细胞的传代与培养

上述细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；

C、细胞毒种的繁殖

用种毒稀释液，将鸡马立克氏病活疫苗毒种稀释成一定浓度，接种生长良好的制苗用细胞系或鸡胚成纤维细胞单层上，36.5-37.5℃吸附1小时，再加入维持液或二次细胞悬液，继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，以EDTA-胰酶细胞分散液消化并分散细胞，收获的细胞悬液用作制苗用毒种；

D、制苗毒液的繁殖

将鸡马立克氏病活疫苗制苗用毒种用维持液稀释，接种于已形成单层的细胞系单层上继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，收获感染细胞；

E、配苗、分装、冻干或置液氮中冻存

将收获的感染细胞，加冻干保护剂和抗生素，定量分装后经冷冻真空干燥为成品；或加冻存保护液和抗生素，混匀后定量分装为成品，置液氮中冻存。

2.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：所述细胞系为鸡胚胎DF-1细胞系。

3.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：鸡马立克氏病活疫苗为鸡马立克氏病血清I型CVI988/Rispens株疫苗，或814株疫苗，或血清II型SB-1株疫苗，或血清III型火鸡疱疹病毒 Fc-126株疫苗，或I+II型，或I+III型，或II+III型，或I+II+III型二价或三价疫苗。

4.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤B中，培养温度为36.5～37.5℃。

5.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤C中，培养温度为36.5～37.5℃。

6.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤D中，培养温度为36.5～37.5℃。

7.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤B中，细胞生长液的配方为：在体积比为5～10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，加入终浓度100～400单位/ml的抗生素，pH调整为7.0～7.2。

8.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：种毒稀释液或维持液的配方为：在体积比为1～5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，或在含有体积比为1～5%新生牛血清的2倍199溶液和2倍水解乳蛋白溶液等量混合液中，加入终浓度100～400单位/ml的抗生素，pH调整为7.0～7.4。

9.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤D中，鸡马立克氏病活疫苗毒种接毒量为500万～1500万PFU/1000ml维持液。

10.根据权利要求1所述的用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，其特征在于：步骤E中，冻存保护液的配方为：体积百分比为15%的新生牛血清、体积百分比为10%的二甲基亚砜的199溶液；冻干保护剂为SPGA；加入抗生素的终浓度为100～400单位/ml。