[发明专利]一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其是一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法。

背景技术

我国目前生产鸡马立克氏病活疫苗所用的细胞为鸡胚成纤维原代细胞。虽然我国已规定制备禽用疫苗的鸡胚及细胞必须来源于无特定病原（SPF）鸡群，但在现实中，由于检测的滞后性及我国家禽饲养环境复杂，使得生产禽用疫苗的鸡胚细胞易造成细胞外源病毒污染，且疫苗效价不高，批间差异大，严重影响疫苗的产量与质量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法。该方法具有生产工艺稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量与质量。利用本发明生产的鸡马立克氏病活疫苗安全性好、免疫效力高，对鸡马立克氏病强毒株、超强毒株的攻击具有完全的免疫保护作用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗的方法，包括以下步骤：

A、选择细胞系作为制苗用细胞；

B、制苗用细胞的传代与培养

上述细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液继续培养，形成单层时，用于继续传代或接种病毒；

C、细胞毒种的繁殖

用种毒稀释液，将鸡马立克氏病活疫苗毒种稀释成一定浓度，接种生长良好的制苗用细胞系或鸡胚成纤维细胞单层上，36.5-37.5℃吸附1小时，再加入维持液或二次细胞悬液，继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，以EDTA-胰酶细胞分散液消化并分散细胞，收获的细胞悬液用作制苗用毒种；

D、制苗毒液的繁殖

将鸡马立克氏病活疫苗制苗用毒种用维持液稀释，接种于已形成单层的细胞系单层上继续培养，当70%及以上单层细胞出现典型马立克氏病细胞病变时，收获感染细胞；

E、配苗、分装或冻干

将收获的感染细胞，加冻干保护剂和抗生素，定量分装后经冷冻真空干燥为成品；或加冻存保护液和抗生素，混匀后定量分装为成品，置液氮中冻存。

作为本发明的一种优选技术方案，所述细胞系为鸡胚胎DF-1细胞系。

为本发明的一种优选技术方案，鸡马立克氏病活疫苗为鸡马立克氏病血清I型CVI988/Rispens株疫苗，或814株疫苗，或血清II型SB-1株疫苗，或血清III型火鸡疱疹病毒 Fc-126株疫苗，或I+II型，或I+III型，或II+III型，或I+II+III型二价或三价疫苗。

为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，培养温度为36.5～37.5℃。

为本发明的一种优选技术方案，步骤C中，培养温度为36.5～37.5℃。

为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，培养温度为36.5～37.5℃。

为本发明的一种优选技术方案，步骤B中，细胞生长液的配方为：在体积比为5～10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，加入终浓度100～400单位/ml的抗生素，pH调整为7.0～7.2。

为本发明的一种优选技术方案，种毒稀释液或维持液的配方为：在体积比为1～5%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，或在含有体积比为1～5%新生牛血清的2倍199溶液和2倍水解乳蛋白溶液等量混合液中，加入终浓度100～400单位/ml的抗生素，pH调整为7.0～7.4。

为本发明的一种优选技术方案，步骤D中，鸡马立克氏病活疫苗毒种接毒量为500万～1500万PFU/1000ml维持液。

为本发明的一种优选技术方案，步骤E中，冻存保护液的配方为：体积百分比为15%的新生牛血清、体积百分比为10%的二甲基亚砜的199溶液；冻干保护剂为SPGA；加入抗生素的终浓度为100～400单位/ml。

    采用上述技术方案所带来的有益效果在于：

    用细胞系替代鸡胚成纤维原代细胞制造鸡马立克氏病活疫苗，可杜绝外源病毒潜在污染的问题，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性。

采用本发明制造的鸡马立克氏病活疫苗病毒含量高，免疫效力好，对鸡马立克氏病强毒株、超强毒株的攻击具有完全的免疫保护作用。

用细胞系生产鸡马立克氏病活疫苗各批间质量差异小，具有生产工艺简单稳定、易操作、产量大、成本低的特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。

附图说明

    图1是本发明实施例2的原理图。

具体实施方式

实施例1