[发明专利]一种重组人血管内皮抑素的提取纯化方法

权利要求书

1.一种重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)工程菌发酵：将工程菌发酵至发酵液OD₆₀₀值为10-15，加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37℃下，对工程菌培养2.5-3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1-0.3mmol/L，继续培养3-5h；所述碳源物质为葡萄糖；所述氮源物质为酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一种或多种；

(2)工程菌破碎：对步骤1)中得到的发酵液进行洗涤、离心，留沉淀物，向发酵液中加入溶菌酶，在2-8℃下，搅拌均匀，破碎至细菌破碎率大于98％，得到破碎后的菌液；

(3)包涵体洗涤：将破碎后的菌液离心，留沉淀物，将沉淀物用含有缓冲剂的洗涤缓冲液进行搅拌洗涤；

(4)重组人血管内皮抑素的变性纯化：采用变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8-10mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液；

(5)变性重组人血管内皮抑素的复性：将蛋白浓度为8-10mg/ml的变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液加入复性液中，混合均匀，2-8℃下静置至少10h，除去所述复性液，得到复性重组人血管内皮抑素；每1L的所述复性液包括以下组分：盐酸胍1-2mol；还原型谷胱甘肽2-3mmol；氧化型谷胱甘肽0.2-0.3mmol；络合剂2-8mmol；所述复性液的pH值为4.0-5.0

(6)复性重组人血管内皮抑素的放置：将步骤5)中得到的复性重组人血管内皮抑素在温度23-27℃下放置5-8天；

(7)重组人血管内皮抑素的层析分离：将步骤6)中的复性重组人血管内皮抑素层析洗脱，收集重组人血管内皮抑素蛋白，即得。

2.根据权利要求1所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为12-15g/L；所述酵母提取物的浓度为4-6g/L；所述胰蛋白胨的浓度为10-20g/L；所述水解酪蛋白的浓度为10-20g/L。

3.根据权利要求1或2所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸。

4.根据权利要求3所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤(4)重组人血管内皮抑素的变性纯化具体包括，

(4a)第一次变性纯化：采用第一变性缓冲液将洗涤后的包涵体溶解，离心，取上清液，稀释所述第一变性缓冲液，再将析出的重组人血管内皮抑素蛋白离心，得到一次变性沉淀物；

(4b)第二次变性纯化：将所述一次变性沉淀物用第二变性缓冲液溶解，离心，取上清液，调整至蛋白浓度为8-10mg/ml，得到变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液。

5.根据权利要求4中所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，在所述步骤(4)中，所述第一变性缓冲液为盐酸胍浓度为5-7mol/L的pH值为7.0-9.0的缓冲液；所述第二变性缓冲液为尿素浓度为6-8mol/L的pH值为7.0-9.0的缓冲液。

6.根据权利要求1所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，每1L的所述复性液还包括pH调节剂10-20mmol。

7.根据权利要求1或6所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于，在所述复性液中，所述还原型谷胱甘肽与所述氧化型谷胱甘肽的摩尔比为8:1。

8.根据权利要求1或2或4或6所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于：在所述步骤(5)中，所述变性纯化后的重组人血管内皮抑素蛋白溶液与所述复性液的体积比为1：(100～200)。

9.根据权利要求8所述的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，其特征在于：在所述步骤(6)中，温度为25℃，放置时间为6天。