[发明专利]一种重组人血管内皮抑素的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于重组蛋白的提取纯化领域，具体涉及一种重组人内皮抑素的提取纯化方法。

背景技术

人血管内皮抑素，是目前作用最强、实验效果最好的肿瘤血管生成抑制剂。实验表明，内皮抑素对血管内皮细胞、生长的血管可产生抑制作用，可对肿瘤的生长和转移起到较好的抑制作用。从其作用机理来讲，人血管内皮抑素是通过抑制人体内肿瘤组织的血液供应使肿瘤缺乏营养物质和氧气而停止生长、进而逐步萎缩直至死亡的，相较于目前临床普遍使用的化疗药物，具有无明显毒副作用的优点，因而受到了医学界的广泛关注。

目前，人血管内皮抑素主要是先通过基因重组技术获得携带人血管内皮抑素基因的工程菌，再将工程菌表达目标蛋白经提取纯化而制备得到的。在重组人血管内皮抑素的提取纯化过程中，由于重组人血管内皮抑素工程菌的特性以及人血管内皮抑素结构的特殊性，在重组人血管内皮抑素的工业生产上，普遍存在目标产物得率低的问题。

具体而言，造成重组人血管内皮抑素产量低的原因主要有以下两方面：(1)为使工程菌表达重组人血管内皮抑素蛋白，需在工程菌发酵时，加入诱导剂进行诱导表达的操作。而现有的诱导表达技术在进行大规模工业生产时，为保证较高的诱导表达量，通常需要耗费大量的培养基、培养液，以保持菌液的菌体浓度处于较低水平，而提高菌体浓度，并同步提高诱导剂用量时，则不仅会由于重组人血管内皮抑素的工程菌对诱导剂的耐受性迅速上升、敏感性显著下降，进而不可避免的出现诱导重组人血管内皮抑素蛋白的表达量下降的现象，无法获得较高的诱导表达量，同时，高浓度的菌体浓度下，也需要浓度较高的培养基、培养液，而菌体在这种环境下必然生长较快，养分易过早耗尽，进而造成菌体过早衰老而自溶，无法获得理想的表达量。无论哪一种情况，均意味着大规模生产中重组人血管内皮抑素的生产效率极低，会造成大量的原料耗费，因而造成最终的目标蛋白收率较低；(2)由于工程菌表达的重组人血管内皮抑素蛋白以包涵体形式存在，所以通常需经过复性才能变成有生物活性的内皮抑素。在复性过程中，重组人血管内皮抑素的二硫键重新形成，其伸展的多肽肽链会由二级结构折叠成三级结构的天然构象，从而使生物活性得以恢复。然而，由于人血管内皮抑素的自然折叠率低，大部分二硫键均需要在复性的过程中形成，而人血管内皮抑素又具有两对二硫键，两对二硫键均需正确配对，才能复性为有生物活性的内皮抑素，加之蛋白质二级结构本身具有可变性，形成正确的二硫键并不容易，错误折叠和聚合往往会造成复性收率较低，因此，实现高的复性收率具有较大的难度。同时，内皮抑素本身呈偏酸性，在中性和碱性环境下活性和溶解性均不稳定、易失活，对环境的敏感性也在一定程度上增加了重组人血管内皮抑素的实现高复性收率的难度，使重组人血管内皮抑素目标产物收率较低。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题是提供一种可适用于重组人血管内皮抑素大规模生产，工程菌发酵过程中可实现在较高菌体浓度下达到高效诱导表达、在变性重组人血管内皮抑素复性过程中达到较高的复性收率的重组人血管内皮抑素提取纯化方法。

本发明的重组人血管内皮抑素的提取纯化方法，包括以下步骤：

(1)工程菌发酵：将工程菌发酵至发酵液OD₆₀₀值为10-15，加入诱导剂IPTG、碳源物质以及氮源物质，使发酵液中IPTG的浓度为0.2-0.4mmol/L，在30-37℃下，对工程菌培养2.5-3.5h，再向其中加入诱导剂IPTG，使发酵液中IPTG的浓度为0.1-0.3mmol/L，继续培养3-5h；

需要说明的是，所述碳源与氮源物质，其选择并不唯一，可提供菌体发酵过程中所需的碳、氮的物质均可。本发明中，优选的，所述碳源物质为葡萄糖；所述氮源物质为酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一种或多种。进一步优选的，所述葡萄糖的浓度为12-15g/L；所述酵母提取物的浓度为4-6g/L；所述胰蛋白胨的浓度为10-20g/L；所述水解酪蛋白的浓度为10-20g/L。

所述工程菌的发酵还包括：取工程菌在LB培养基中扩增后，按发酵体积的5-8％接种量，接种至发酵培养基中，再发酵至OD₆₀₀值10-15。其中，所述LB培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L。

(2)工程菌破碎：对步骤1)中得到的发酵液进行洗涤、离心，留沉淀物，向发酵液中加入溶菌酶，在2-8℃下，搅拌均匀，破碎至细菌破碎率大于98％，得到破碎后的菌液；