[发明专利]来自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其调节畜禽免疫应答的用途

说明书

技术领域：

本发明涉及调节畜禽免疫应答的丁酸梭菌细胞壁脂磷壁酸，所述免疫应答是由致病菌或其菌体成分诱导。 

背景技术：

肠道传染病是集约化畜禽养殖中最常见的传染病之一，主要由致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌等病原引起。这类疾病的传染性强，死亡率高，对畜禽养殖业的危害十分严重。这些肠道传染病病原还可能从动物传播到人，引发人体肠道疾病，对消费者的身体健康造成潜在威胁。目前，饲料中添加抗菌药物仍是防治畜禽肠道传染病的主要手段。但这一防治手段带来的系列问题已成为社会关注的焦点：(1)长期使用抗菌药物导致病原菌产生耐药性，这给动物甚至人类传染性疾病防控带来了更大的困难；(2)会在畜禽肉蛋奶类产品产生抗菌药物残留，危害消费者的健康；(3)未被畜禽消化、吸收和降解的抗生素随动物粪便排出体外，对土壤、水体造成污染，间接危害消费者的健康。在传统的畜禽养殖过程中，畜禽肠道传染病的发生率则很低。这是因为正常动物肠道中生存者大量共生菌，这些共生菌能够通过群体效应，抑制病原菌在肠道中的粘附、定植与侵染，调控动物肠道免疫应答反应，防止肠道传染病的发生。基于这一背景，人们开发了多种微生态制剂，通过调节动物肠道菌群结构来防治动物肠道传染病。微生态制剂具有不导致细菌产生耐药性、无残留、环境友好等优点，但微生态制剂的作用效果受动物种类、年龄、养殖环境、饲料加工方式和投喂方式等多种因素影响，不易于实施。 

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能够改善畜禽的肠道免疫功能，抑制病原菌在肠粘膜细胞表面的粘附定植，降低肠道传染病发病率，提高畜禽养殖业经济效益的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸。 

本发明运用TritonX-114破碎丁酸梭菌细胞，再用离子交换树脂分离纯化脂磷壁酸，进而利用截留分子量为3500的半透膜进行透析，除去其中的杂质，获得纯的脂磷壁酸；具体制备步骤包括： 

(1)向40-60mmol/L、pH6-7的Tris-HCl缓冲液中加TritonX-114(TRITONX-114CAS:9036-19-5)，配制成质量百分比为1.5-2.5％的TX-114溶液(即TRITONX-114质量百分比为1.5-2.5％的TRITONX-114溶液)，置于4℃冰箱保存，备用； 

(2)取8-16mL经45-50h培养的丁酸梭菌液于若干支质量已知的塑料离心管中，常温、4500-5000rpm离心25-40min，除去上层培养液后再称各管质量，计算得到菌体湿重； 

(3)按照每1g湿菌(步骤2的菌体)添加8-12mL步骤(1)的1.5-2.5％％TX-114溶液的比例混合，磁力搅拌器搅拌裂解菌体25-40min，4℃静置过夜；然后4℃、4500-5000rpm离心25-40min，去除细菌碎片，收集上层提取物；提取物置于45-50℃水浴中25-30min，然后常温4500-5000rpm离心25-40min，收集上层水相，即为脂磷壁酸的粗提取物； 

(4)先用0.1M(mol/L)pH4.7的醋酸铵缓冲液预平衡DEAE-纤维素层析柱(2×20cm即直径×长度)，然后向脂磷壁酸粗提取物中加入5倍其体积的0.1MpH4.7的醋酸铵缓冲液，稀释后过柱；用同一缓冲液(0.1MpH4.7的醋酸铵缓冲液)洗脱，直到洗脱液275nm吸光度A275低于0.01，然后用1.0mol/LpH4.7醋酸铵缓冲液洗脱结合于柱上的脂磷壁酸，整个过程用试管收集洗脱液，A₂₇₅监测脂磷壁酸洗脱峰；得到脂磷壁酸。 

作为优选，本发明步骤(1)的Tris-HCl缓冲液为50mmol/L、pH6.5，TX-114溶液质量百分比浓度为2％。 

作为优选，步骤(3)每1g湿菌添加10mL的2％TX-114溶液。 

本发明步骤(2)的丁酸梭菌液培养条件为：37℃厌氧培养，其培养基为MRS培养基，MRS培养基配方：酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、吐温-801g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸锰0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20g、蒸馏水1000mL，pH7.0。