[发明专利]一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种发酵工艺，适用于抗菌肽的生产，尤其适用于利用枯草芽孢杆菌生产抗菌肽，具体地说，涉及一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，属于生物发酵技术领域。

背景技术

抗菌肽 (Antimicrobial peptides，AMP) 是指生物体内经诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是天然免疫防御系统的一部分，此类蛋白通常具有耐酸性能好、抗菌谱广、水溶性好、安全性高以及作用快速等特点，其作用机理是，抗菌肽通过蛋白凝聚效应，将其末端尾链直接插入细菌细胞膜，打孔形成一个通道，使细菌内容物外泄导致细菌死亡。与抗生素相比，抗菌肽具有不杀灭益生菌、提高机体免疫机能、无副作用、无残留、无耐药性、可长期使用等优点。因抗菌肽所具有的特性，可将其广泛应用于多个领域。在医药方面，抗菌肽可平衡和调节炎症应答并激发抗原特异性的适应性免疫反应。在食品防腐方面，抗菌肽作为一种天然防腐剂，毒副作用小，可降解，使用安全，甚至对人体有保健作用。在饲料添加剂方面，抗生素的滥用已极大地影响了我国畜牧业的发展，而抗菌肽恰恰解决了其耐药残留、抗药性、环境污染等问题，是一种环保型高效饲料添加剂。

在以上这些领域，我国与国际上一些发达国家相比技术上和普及方面还有不小的差距，并且由于各方面的原因，我国目前尚未全面禁止饲用抗生素，而多数抗生素饲料添加剂为国外已淘汰或将被禁用的产品，这些问题无疑将影响我国畜产品在国际上的声誉，并造成巨大的经济损失。由于微生物生产抗菌肽有成本低、无毒害、周期短等明显优点，加快抗菌肽的研究已势在必行，但当前研究主要集中在乳酸菌，而乳酸菌产生的抗菌肽存在着耐热性差、抗菌谱窄等缺陷。枯草芽孢杆菌产的抗菌肽抑菌谱广、稳定性高，开始引起国内外研究人员的注意，而对于其发酵产生抗菌肽的工业化生产，目前仍然面临成本过高，过程复杂，产物效价较低等问题。

发明内容

本发明所解决的技术问题是针对现有技术的不足，以枯草芽孢杆菌为生产菌株，通过菌体活化、一级种子液制备、二级种子液制备、发酵液制备等步骤制备抗菌肽成品，其培养基成分和发酵步骤简单、生产成本较低且产品效价较高。

为解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：一种枯草芽孢杆菌生产抗菌肽的发酵工艺，包括如下依次进行的步骤：菌株活化、种子罐培养和发酵罐发酵。

一种优化方案，所述种子罐培养包括一级种子罐培养；

所述一级种子罐培养包括以下步骤：将YPD培养基装入摇瓶中，灭菌，然后接入菌株活化步骤中得到的活化后的枯草芽孢杆菌单菌落，于35～37℃恒温振荡培养16～20 h，转速为160～200 rpm，得到摇瓶发酵液。

另一种优化方案，所述种子罐培养还包括二级种子罐培养；

所述二级种子罐培养包括以下步骤：在发酵罐中装入发酵培养基，发酵培养基的加入量占发酵罐总体积的50%，发酵罐灭菌冷却后，将一级种子罐培养步骤中得到的摇瓶发酵液按照发酵培养基体积的0.5%～1.5%进行接种，得到枯草芽孢杆菌菌液。

再一种优化方案，所述二级种子罐培养步骤中接种的发酵控制条件为：温度为35～37℃，转速为300～400 rpm，时间为16～20 h，接种前起始pH值为7.8，通风量为1:0.5。

进一步的优化方案，所述发酵罐发酵包括以下步骤：将种子罐培养步骤中得到的枯草芽孢杆菌菌液以3%～8%的体积比接种于发酵罐中，在35～37℃、120～180 rpm条件下持续24～48 h，接种前起始pH值为7.8，通风量为1:0.6，末期升温10～15℃，维持2 h。

再进一步的优化方案，所述菌株活化采用三次YPD平板划线法；

第一次YPD平板划线包括以下步骤：取枯草芽孢杆菌冻干粉加入YPD培养基中，待完全溶解后在YPD平板上进行第一次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37℃温箱中培养24 h；

第二次YPD平板划线包括以下步骤：第一次YPD平板划线培养后挑取单菌落在另一YPD平板上进行第二次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37℃温箱中培养24 h；

第三次YPD平板划线包括以下步骤：第二次YPD平板划线培养后挑取单菌落在另一YPD平板上进行第三次划线，整个过程保持无菌，划线后的YPD平板置于37℃温箱中培养24 h。

更进一步的优化方案，所述YPD培养基，其有效成分包括：酵母膏、蛋白胨和葡萄糖；

所述YPD培养基采用以下步骤制备：

（1）取酵母膏10份和蛋白胨20份溶于900份纯化水中，121℃灭菌20min；