[发明专利]一种检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种检测阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的方法及其试剂盒和引物。

背景技术

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)隶属于克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)(即原阪崎肠杆菌)，是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌。经临床研究发现阪崎克罗诺杆菌是克罗诺杆菌属临床感染病例中最常见的条件致病菌，阪崎克罗诺杆菌菌株能够引起婴儿致命的感染，致死率高达40％-80％。它通常能导致婴儿严重的临床症状，例如脑脓疡，脑膜炎，坏死性小肠结肠炎和全身性败血症。曾经有在婴儿配方粉中分离到阪崎克罗诺杆菌菌株的报道。阪崎克罗诺杆菌菌株是通过配方粉危害婴幼儿健康的重要条件性致病菌。新生婴儿或早产儿都存在通过食用污染有阪崎克罗诺杆菌进驻的婴儿配方粉而感染阪崎克罗诺杆菌菌株的风险。在污染环节调查中发现，整个婴幼儿配方粉生产工艺流程中，可检测到阪崎克罗诺杆菌的污染点占到全部取样点的31％。因此，对阪崎克罗诺杆菌菌株快速鉴定与鉴别是实现有效控制的基础。

克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)于2008年被分为5个新种(其中将Cronobacter sakazakii称为新组合)、1个阪崎克罗诺杆菌基因种(Genomospeciese)和3个新亚种，到2012年克罗诺杆菌属经多序列比对发现，最终确定将该属分为7个种。尽管关于克罗诺杆菌的分类和名称已变，但目前的检测仍然沿用程序式的阪崎肠杆菌标准检测方法，以传统生化反应进行鉴定，一般需要18～24h，而且无法区分为哪一种，这显然已经不能满足对阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)检测的需求。在鉴别方面，尽管已有扩增片段长度多态性分析(Amplified fragment length polymorphismas，AFLP)、16S rRNA全序列比较、DNA？DNA杂交实验及多位点测序等多种可靠方法，但这些根据遗传特征的分析方法耗时长、工作量大。因此，本领域目前仍然缺乏对阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)菌种的高效率的鉴定与鉴别方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的对阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的检测方法耗时长、操作繁琐等缺陷，而提供一种新的检测阪崎克罗诺杆菌的方法及其试剂盒和引物。以本发明的方法检测阪崎克罗诺杆菌菌株，检测时间短，成本低，检测结果特异，能够特异性地检测阪崎克罗诺杆菌菌株，而不受克罗诺杆菌属(Cronobacter spp.)内的其他种的干扰，结果判定简单，在实际应用中非常方便。

本发明提供的技术方案之一是：一种非疾病的诊断或治疗目的的检测阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以步骤(1)所得的基因组DNA为模板，以序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对进行PCR反应；和

(3)检测步骤(2)所得反应产物中498bp单一扩增产物的存在。

根据本发明，步骤(1)中，所述的提取待测样品的基因组DNA的方法为本领域常规，如使用市售的各种基因组DNA提取试剂盒进行操作。

步骤(2)中，所述的PCR反应为本领域常规，只要能够扩增出阪崎克罗诺杆菌特异性的基因片段即可。

较佳地，所述PCR反应的反应体系包括：1×PCR反应缓冲液，10-15mmol/L Mg²⁺，0.2-0.3mmol/L dNTP，0.1-0.3μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，Taq酶0.05-0.1U/μL，和DNA模板10-100ng/μL。所述PCR反应的反应程序为：①94～95℃，3～5min；②94～95℃，30～40s；③60～62℃，30～40s；④68～72℃，30～40s；步骤②至④共30～35个循环；⑤68～72℃，7～10min；⑥4～15℃保存。